Petra Kapková

• Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Inhibitoren der Acetylcholinesterase (AChE) untersucht, die als potentielle Substanzen zur Behandlung von Morbus Alzheimer eingesetzt werden können. Die Hemmwirkung der einzelnen Substanzen wurde mittels Ellman-Test überprüft. Gemeinsames Strukturmerkmal der Substanzklasse, von der im ersten Teil der Arbeit ausgegangen wurde, war das Grundgerüst des AChE-Reaktivators TMB4 [1,1´-Trimethylen-bis(4-Formyl-Pyridiniumbromid)-Dioxim]. Anhand der biologischen Daten konnte beobachtet werden, dass die Art derIm Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Inhibitoren der Acetylcholinesterase (AChE) untersucht, die als potentielle Substanzen zur Behandlung von Morbus Alzheimer eingesetzt werden können. Die Hemmwirkung der einzelnen Substanzen wurde mittels Ellman-Test überprüft. Gemeinsames Strukturmerkmal der Substanzklasse, von der im ersten Teil der Arbeit ausgegangen wurde, war das Grundgerüst des AChE-Reaktivators TMB4 [1,1´-Trimethylen-bis(4-Formyl-Pyridiniumbromid)-Dioxim]. Anhand der biologischen Daten konnte beobachtet werden, dass die Art der Substitution die inhibitorische Aktivität der Verbindungen wesentlich beeinflusst. Am wirksamsten von allen Bispyridinium-Derivaten zeigte sich das 2,6-chlorierte Derivat DUO3 (IC50 = 0.34 μM), gefolgt von monobenzyl-substituiertem UNO3, bismethylsubstituiertem TBM und unsubstituiertem TMB4. Weiterhin wurde der Bindungsmodus der DUO-Substanzen im aktiven Zentrum der AChE untersucht. Die Docking-Studien an Substanzen der DUO-Klasse zeigten ein einheitliches Bindungsmodel, welches folgende Wechselwirkungen be-inhaltet: π-π-„stacking“ zwischen dem Benzylring einer DUO-Substanz und dem Trp84 am Grunde der Bindetasche des Enzyms, face-to-face Wechselwirkung (π-π und Kation-π) zwischen dem Pyridiniumring und Trp334 oder Phe331 der aromatischen Furche. Bei 60% der gedockten Strukturen wurde eine face-to-face-Wechselwirkung an der anionischen peripheren Seite (PAS) der AChE-Tasche festgestellt. Weiterhin wurden neue optimierte Inhibitoren entwickelt. Die Bispyridinium-Struktur der DUO-Derivate wurde um den aus der Furche herausragenden Benzylring gekürzt. Als Leitstrukturen dienten die AChE-aktivsten Substanzen DUO3 (2,6-Cl-Derivat) und DUO12 (2-Cl-Derivat) sowie ein bisphthalimidomethyl-substituiertes TMB4-Derivat (WDUO). Die aktivste Verbindung der Pyridinium-Klasse war die Phthalimid-Phenyl-substituierte Substanz 3c (IC50 = 0.073 μM). Ihre inhibitorische Aktivität gegenüber AChE befand sich im Bereich der des Tacrins (IC50 = 0.044 μM). Sie zeigte eine sehr gute AChE-Selektivität; die BChE hemmte sie um den Faktor 34 schwächer. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde nicht nur das rationale Design angewandt, um zu viel versprechenden Kandidaten bezüglich klinischen Einsatzes zu gelangen. Auch das Verfahren der „Random Chemistry“ kam zum Einsatz, um neue und interessante Strukturen zu erzeugen, die eventuell bessere Eigenschaften als die Ausgangssubstanz besitzen. Der Grundgedanke dieses Verfahrens liegt in der Ausnutzung der durch gamma-Strahlen (60Co-Quelle) induzierten Radiolyse des Lösungsmittels, welches seine primären Produkte zur chemischen Reaktion mit dem in ihm gelösten Stoff zur Verfügung stellt. Aus den entstandenen Produkten wurden durch spezifische biologische Testung (Inhibition der AChE) positiv reagierende Komponenten herausselektiert. Die Proben wurden zuerst im Ganzen auf ihre Fähigkeit, die AChE zu hemmen, geprüft. Nach der bioaktivitätsgeleiteten Fraktionierung und Subfraktionierung mittels HPLC erwies sich die Tacrin/MeOH-Probe als die, mit dem interessantesten Aktivitätsprofil. Die Charakterisierung der entstandenen Verbindungen bezüglich ihrer Vielfältigkeit erfolgte mittels ESI-Massenspektrometrie und UV-Spektroskopie. Die Substanz mit höchster Hemmwirkung gegenüber AChE (Peak E der Tacrin/MeOH-Probe) wurde nach der Isolierung der Reinheitsprüfung und Strukturaufklärung mittels NMR-, FTIR- und (Tandem)-ESI-Massenspektrometrie zugeführt und auf ihre biologische Wirkung hin untersucht.…
• This study aimed at developing and biological screening of new potential acetylcholin-esterase (AChE) inhibitors. They represent the most widely used class of therapeutics for treatment of cognitive disorders such as Alzheimer´s Disease and neuromuscular diseases. The inhibitory potency toward acetylcholinesterase was evaluated by means of the spectrophotometric Ellman test. At first, the series of AChE inhibitors of bispyridinium type derived from TMB4 [1,1´-Trimethylene-bis-(4-formyl-pyridinium bromide) dioxime] was tested against AChE. InThis study aimed at developing and biological screening of new potential acetylcholin-esterase (AChE) inhibitors. They represent the most widely used class of therapeutics for treatment of cognitive disorders such as Alzheimer´s Disease and neuromuscular diseases. The inhibitory potency toward acetylcholinesterase was evaluated by means of the spectrophotometric Ellman test. At first, the series of AChE inhibitors of bispyridinium type derived from TMB4 [1,1´-Trimethylene-bis-(4-formyl-pyridinium bromide) dioxime] was tested against AChE. In essence, the substitution pattern influenced the inhibitory potency against the enzyme. The most potent inhibitor of the bispyridinium-class was the 2,6-halogenated compound DUO3 (IC50 = 0.34 μM), followed by monobenzyl substituted (UNO3), bismethyl substituted (TBM), and unsubstituted derivatives of TMB4. This experimental finding could be explained by docking studies whose goal was to thoroughly explore possible binding modi of this type compounds. One major observation was that almost all of the compounds docked display a general binding mode; they are a kind of ditopic inhibitors which bind to both the catalytic and the peripheral sites of the enzyme. The interactions found after docking include π-π-stacking with amino acid residues of the anionic substrate binding site (Trp84), cation-π contacts with Phe331 and Tyr334 of aromatic gorge and the peripheral anionic binding site (Trp279). This type of interactions is already known for other potent AChE-inhibitor donepezil. Moreover, all compounds were potentially able to bind inside the active side gorge, although, not the whole molecule was able to interact with amino acid residues of the enzyme. This “size problem” of the DUO-ligands may be one reason for their reduced activity as compared to other potent AChE-inhibitors e.g. donepezil, tacrine. Using the hypothesis of the study on bisbenzylethers of bispyridinium compounds which were too long to tightly fit into gorge of AChE, shorter compounds of pyridinium type were developed. This new series of compounds was systematically shortened from 2,6-dichloro-benzyl, 2-chlorobenzyl and phthalimidomethyl ditopic compounds and substituted with several moieties on contralateral end of molecule. The most potent pyridinium compound was 3c (IC50 = 0.073 μM), the activity of which was in the same range of inhibition concentration as tacrine (IC50 = 0.044 μM). In addition, the affinity of 3c toward BChE was rather low (IC50 = 2.49 μM), indicating a lower degree of side effects. In addition to the rational drug design new potent AChE-inhibitors were generated through serendipitous but reproducible approach – via random chemistry. In order to achieve this objective, compound libraries were generated by using gamma-irradiation as an initiator of random free radical recombinations in aqueous or alcohol solution of starting compounds. The bioassay-guided-HPLC-fractionation as a deconvolution strategy of the gained product library was employed. Where the activity in a single first round fraction was observed further steps of fractionation were warranted till a potent hit was observed. The biological screening of first round fractions revealed the tacrine/methanol mixture to be the one with most active fractions toward AChE. Hence, further research efforts were focused on separation, deconvolution, isolation and characterization of biologically active principles. HPLC/ESI-MS (high performance liquid chromatography-electrospray ionisation mass spectrometry), NMR and UV spectroscopy were used to determine the origin and character of generated compounds, first of all that of active ones.…