Abstract

Aspergillus fumigatus ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der ubiquitär in der Umwelt vorhanden ist. Die schwerwiegende Krankheit, die er verursacht, ist die invasive Aspergillose, welche nur bei immungeschwächten Patienten auftritt und bis heute nur sehr schwierig zu diagnostizieren und zu heilen ist. Die Sporen von A. fumigatus können aufgrund ihrer geringen Größe bis in die Alveolen der Lunge gelangen. Dort bilden Makrophagen die erste Verteidigungslinie, indem sie die Sporen phagozytieren. Die Phagozytose ist Bestandteil der angeborenen Immunantwort und ein initialer Schritt bei der Bekämpfung von A. fumigatus-Sporen durch Makrophagen. Das Verstehen dieses Prozesses gewinnt durch die stetige Zunahme der Patienten mit invasiver Aspergillose immer größere Bedeutung und ist Gegenstand intensivster Forschung. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Interaktionen von murinen und humanen Makrophagen mit A. fumigatus-Sporen untersucht. Die Fragestellung wurde aus zwei unterschiedlichen Perspektiven betrachtet. Zum einen wurde die Oberfläche der A. fumigatus-Sporen analysiert; zum anderen wurden die Interaktionen von A. fumigatus mit phagozytierenden Zellen erforscht. Um die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen in murinen und humanen Zellen genauer charakterisieren zu können, wurde in dieser Arbeit der so genannte „Biotin-Calcofluor Staining Assay“ (BCS-Assay) entwickelt. Mit Hilfe dieser Methode war es möglich, zwischen extra- und intrazellulären Sporen zu unterscheiden, ohne auf die Anwesenheit von Antikörpern angewiesen zu sein. Mit Hilfe von diversen Inhibitoren konnte der Mechanismus der Phagozytose genauer untersucht werden. So konnte gezeigt werden, dass die Aufnahme von A. fumigatus-Sporen ein Aktin-abhängiger Prozess ist und dass Makrophagen für die Phagozytose die Aktivierung der Phosphoinositid 3 Phosphat-Kinasen und von Tyrosin-Kinasen benötigen, insbesondere diejenigen der scr Familie. Butanedion Monoxim, ein Inhibitor der Myosinmotor-Aktivität, blockierte ebenfalls effizient die Sporenaufnahme. Die weiteren Untersuchungen der Phagozytoseprozesse von A. fumigatus-Sporen erfolgten u.a. mit Hilfe von Fluoreszenz- und elektronenmikroskopischer Aufnahmen. In der Immunfluoreszenz ließen sich Tyrosin-phosphorylierte Proteine in den Aufnahmestrukturen detektieren, und elektronenmikroskopische Aufnahmen infizierter Makrophagen zeigten so gennante „Ruffle“-Strukturen. Diese Tatsache deutet darauf hin, dass A. fumigatus-Sporen durch einen „Trigger“-ähnlichen Mechanismus aufgenommen werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden die Rezeptoren der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen charakterisiert. Die Ergebnisse von Meier und ihren Kollegen zeigten bereits, dass die Erkennung von A. fumigatus durch Makrophagen mittels Toll-like Rezeptor 2 und TLR4 erfolgt. In der vorliegenden Arbeit wurde nun auch der Frage nachgegangen, welche Rolle TLR2 und TLR4 bei der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen spielen. Hierzu wurden aus den Mausstämmen C3H/HeN (WT), C3H/HeJ (TLR4-), C3H/HeN TLR2-/- (TLR2-) und C3H/HeJ TLR2-/- (TLR2-/4-) murine Peritonealmakrophagen mittels Peritoneallavage entnommen, mit A. fumigatus-Sporen infiziert und mit Hilfe des BCS-Assays ausgewertet. Es konnte gezeigt werden, dass Toll-like Rezeptor 2 und nicht Toll-like Rezeptor 4 für eine effiziente Phagozytose benötigt wird. Dieses Ergebnis ließ sich wiederum mit Hilfe eines anti TLR2-Antikörpers bestätigen, da dieser auch die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen, aber nicht von Kontrollbeads blockieren konnte. Des Weiteren wurde untersucht, ob der von Brown und seinen Mitarbeitern entdeckte Dectin-1 Rezeptor ein potentieller Phagozytoserezeptor von A. fumigatus-Sporen ist (Brown et al., 2001). Es konnte gezeigt werden, dass Laminarin, ein lösliches ß 1-3 Glucan, die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen durch Makrophagen blockierte. Außerdem ließ sich mit einem anti-Dectin-1 Antikörper die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen in Makrophagen hemmen. Zudem ließ sich Dectin-1 mit diesem Antikörper in infizierten Makrophagen in der Immunfluoreszenz detektieren. Mit einem weiteren Antikörper konnte beta-1-3 Glucan, ein wichtiger Bestandteil der pilzlichen Zellwand, auf ruhenden Sporen detektiert werden. Es zeigte sich, dass die Menge an  1-3 Glucan eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von A. fumigatus-Sporen spielt. Vergleiche zwischen ruhenden und angeschwollenen Sporen zeigten, dass angeschwollene Sporen, welche größere Mengen an ß 1-3 Glucan auf ihrer Oberfläche besitzen, effizienter phagozytiert werden können. Auch die A. fumigatus pksP-Mutante, welche mehr  1-3 Glucan auf ihrer Oberfläche besaß, wurde effizienter phagozytiert. Betrachtet man die intrazelluläre Signaltransduktionskaskade, so deuten die Daten darauf hin, dass die Dectin-1-gesteuerte Phagozytose von A. fumigatus-Sporen abhängig von der Syk-Kinase verläuft. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Dectin-1 und TLR2 für eine effiziente Phagozytose von A. fumigatus-Sporen benötigt werden. Die Ergebnisse legen allerdings nahe, dass außer Dectin-1 und TLR 2 noch weitere Rezeptoren bei der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen beteiligt sind. Ein genaues Verständnis der bei der Phagozytose ablaufenden Erkennungsprozesse und der nachgeschalteten Signaltransduktionskaskaden könnte in Zukunft ausgenutzt werden, um die Effiziens der Phagozytose auch in immungeschwächten Patienten zu erhöhen und sie so zu schützen.