Abstract

Die PCR for Antigen Receptor Rearrangements (PARR) ist mittlerweile fester Bestandteil in der Lymphomdiagnostik beim Hund. Während die Analyse der PCR-Produkte anfangs überwiegend mittels Polyacrylamidgelelektrophorese durchgeführt wurde, stehen heute weitere Analyseverfahren zur Verfügung. Eines dieser Verfahren ist die Schmelzkurvenanalyse, bei der mittels Echtzeit-PCR die PCR-Amplifikate durch Fluorochrome detektiert werden. Die Schmelzkurvenanalyse folgt im Anschluss an die PCR-Amplifizierung. Die PCR-Produkte werden schrittweise erhitzt, bis sie ihren Schmelzpunkt erreichen und bei Zerfall der Doppelhelixstruktur ein Abfall der Fluoreszenz detektiert wird. In der vorliegenden Arbeit wurde ein mathematisches Verfahren zur objektiven Auswertung der Schmelzkurvenanalyse entwickelt. Das Verfahren beruht auf der Berechnung des maximalen Fluoreszenzabfalls ΔFmax (%) innerhalb einer definierten Temperaturerhöhung ΔT. Anhand dieser Methode wurden zur Unterscheidung von monoklonalen und polyklonalen Proben Grenzwerte für ΔFmax (%) für jeden Primer entwickelt. Bei der üblichen visuellen Auswertung der Funktion der negativen ersten Ableitung -(ΔF/ΔT)/T wurden in der Regel subjektive Kriterien zur Auswertung herangezogen. Die Auswertung der negativen ersten Ableitung der Fluoreszenzkurve statt der Fluoreszenzkurve selbst birgt die Fehlerquelle, dass die Höhe der Anfangsfluoreszenz vor Beginn der Schmelzkurvenanalyse nicht mit einbezogen wird. Dadurch kann es zu Ungenauigkeiten kommen. Der Vorteil der hier präsentierten mathematischen Auswertung liegt darin, dass objektive mathematische Kriterien verwendet werden und die Kurve des Fluoreszenzabfalls direkt ausgewertet wird, so dass auch die Anfangsfluoreszenz mit einbezogen wird. Bei der Untersuchung von 34 Lymphompatienten und 28 Kontrolltieren ergaben sich eine Sensitivität von 79 % und eine Spezifität von 93 %. 2 der 28 Kontrolltiere zeigten ein falsch-positives Ergebnis. Einer dieser Patienten zeigte eine Infektion mit Leishmaniose, der andere war wegen eines positiven Anaplasmose-Antikörpernachweises kürzlich mit Doxycyclin therapiert worden. Das Detektionslimit in Verdünnungsreihen war bei Berechnung von ΔFmax (%) sehr hoch. Die Proben zeigten bereits bei einem Tumor-DNA-Anteil von 12,5 % (B-Zell Primer IgH major) und 50 % (T-Zell-Primer TCRγ) ein polyklonales Ergebnis. Bei Anwendung der in der Humanmedizin für die Bewertung des Detektionslimits üblichen Kriterien lag das Detektionslimit bei 3,125 % für den B-Zell-Primer und bei 6,25 % für den T-Zell-Primer. Wie bereits in anderen Studien zur PARR gezeigt wurde, ist auch die SKA zur Immunphänotypisierung nur dann geeignet, wenn ein monoklonales Ergebnis für entweder den B-Zell-Rezeptor oder den T-Zell-Rezeptor gamma vorliegt. Es ist empfehlenswert, die Lymphomdiagnose nicht allein auf das Ergebnis der PARR zu stützen, sondern diese durch Zytologie oder Histologie zu ergänzen. Bei positivem Ergebnis der PCR und negativer Zytologie/Histologie sollte der Infektionsstatus des Tieres erhoben werden.