LDL-Carbamylierung als Mechanismus endothelialer Dysfunktion bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung

Abstract

1.1 cLDL induziert endotheliale Dysfunktion bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung (CKD) Erhöhte LDL-Cholesterinspiegel sind insbesondere auch bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung wesentlich mit Atherosklerose und dem Auftreten von Gefäßkomplikationen vergesellschaftet. Vermehrt werden bei diesen Patienten Serumproteine posttranslational carbamyliert. Die Carbamylierung von Lipoproteinen kann die Schaumzellenbildung und endotheliale Dysfunktion begünstigen, eine mechanistische Bestätigung dieser Hypothese wurde bislang nicht erbracht. In dieser Studie wurden die endothelialen Effekte carbamylierten LDLs untersucht. Zunächst wurde LDL aus dem Serum gesunder Probanden isoliert und anschließend ex vivo carbamyliert. ESR-spektroskopisch zeigte sich eine gesteigerte ROS- und verminderte NO-Produktion nach Inkubation von murinen Aortenringen sowie in humanen aortalen Endothelzellen (HAEC) nach Inkubation mit carbamyliertem LDL (cLDL). Western Blot-Analysen ergaben einen durch cLDL hervorgerufenen aktivitätsmindernden Phosphorylierungszustand der endothelialen NO-Synthase (eNOS). Der als Entkopplung bezeichnete Zerfall der dimeren eNOS in Monomere, welche folglich ROS statt NO bilden, wurde ergänzend immunfluoreszenzmikroskopisch durch cLDL-abhängige S-Glutathionylierung aufgezeigt. Zudem konnte LOX-1 als Rezeptor identifiziert werden, der diese Effekte von cLDL auf HAEC vermittelt. C57BL/6J-Wildtypmäuse wiesen nach Injektion mit cLDL erhöhte ROSSpiegel in Vollblut und explantierten Aortenringen auf, wobei sich in Lox1 transgenen C57BL/6J- Mäusen mit endothelialer Überexpression von LOX-1 eine weitere deutliche Zunahme der Effektstärke objektivieren lies. Durch Inkubation mit spezifischen Inhibitoren wurden die Beteiligung der NADPH-Oxidase (Inhibition durch Captopril/ DPI) sowie p38 MAPK (Inhibition durch SB202190) an der LOX-1 Rezeptoraktivierung nachgeschalteten zellulären Signalkaskade bewiesen. Die klinische Relevanz der LDL-Carbamylierung verdeutlichte der Vergleich in vivo carbamylierter Lysin-Reste im LDL gesunder Probanden (kein Nachweis) und chronisch Nierenkranker (54 ± 4) mittels MALDI-ToF-Massenspektroskopie. Analog der ESR-spektroskopischen Studien mit ex vivo carbamyliertem LDL führte das aus dem Plasma von CKD-Patienten isolierte LDL zu einer signifikanten Reduktion der NO-Produktion in Zellkulturversuchen an HAEC. In einer klinischen Studie an Patienten mit CKD zeigte sich, dass hohe LDLCarbamyl- Lysinkonzentrationen mit höherer Mortalität und Inzidenz kardiovaskulärer Ereignisse assoziiert sind. Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass cLDL bei chronisch Nierenkranken in klinisch relevantem Ausmaß endotheliale Dysfunktion über eine gesteigerte ROSProduktion und eine verminderte NO-Bioverfügbarkeit induziert. Auf molekularer Ebene werden hier nach LOX-1 Rezeptorbindung p38 MAPK und NADPH-Oxidase aktiviert sowie eNOS gehemmt und via S-Glutathionylierung entkoppelt. Diese Ergebnisse weisen auf einen wichtigen neuen Pathomechanismus für die Entstehung kardiovaskulärer Ereignisse bei Patienten mit Niereninsuffizienz hin. Zudem konnte cLDL als neuer Biomarker sowie therapeutischer Angriffspunkt identifiziert werden.

1.2 cLDL induces endothelial dysfunction in patients with chronic kidney disease (CKD) Elevated levels of LDL-cholesterol are crucially involved in the pathogenesis of atherosclerosis and subsequent cardiovascular complications. This also applies to CKD-patients, whose serum proteins are increasingly subject to posttranslational carbamylation. Lipoprotein carbamylation is thought to promote foam cell formation and endothelial dysfunction but the underlying molecular mechanisms remained unclear. Here, we investigated the endothelial effects of carbamylated LDL. LDL was isolated from healthy donors’ serum and carbamylated ex vivo. ESR-spectroscopy showed an increased production of ROS and diminished release of NO in murine aortic rings and human aortic endothelial cells (HAEC) after incubation with cLDL. Western blot analyses revealed a cLDL-induced, activity-diminished phosphorylation state of eNOS, a key regulator of cellular redox state. In addition, uncoupling called disaggregation of dimeric eNOS into monomer units, which promotes the production of ROS instead of NO, was shown to be due to S-glutathionylation of eNOS. Moreover, LOX-1 was identified as the receptor mediating these adverse endothelial effects of cLDL. While C57BL/6J- wild type mice already featured increased levels of ROS in whole blood and explanted aortic rings after injection with cLDL, an even greater increase was observed in Lox1 transgenic C57BL/6J- mice exhibiting endothelial overexpression of LOX-1. Using specific inhibitors, further experiments demonstrated an involvement of NAPH-oxidase (inhibition by captopril/ DPI) and p38 MAPK (inhibition by SB202190) in the cellular downstream effects of LOX-1 receptor stimulation by cLDL. The clinical relevance of LDL carbamylation was proven by comparison of carbamylated lysine residues in LDL of healthy donors (none detectable) and CKD patients (54 ± 4) using MALDI-ToF mass spectrometry. Similar to LDL carbamylated ex vivo, incubation with LDL isolated from CKD patients’ plasma led to a significant reduction of basal NO-production in HAEC culture experiments. Notably, in a prospective clinical study of CKD patients, we could prove the clinical relevance of these experimental findings. Carbamyl-lysine levels in LDL were associated with increased all-cause mortality and cardiovascular event rate. In summary, cLDL induces endothelial dysfunction through increased production of ROS and diminished bioavailability of NO, in a clinically relevant dimension in CKD patients. LOX-1 receptor binding leads to activation of p38 MAPK and NADPHoxidase such as inhibition and uncoupling of eNOS by S-glutathionylation. These findings highlight on carbamylation of LDL as an important pathomechanism for CKD-associated accelerated cardiovascular disease. Moreover, cLDL was identified as a novel biomarker and potential therapeutic target.