Über Kalziumsignale und Zytotoxizität menschlicher natürlicher Killerzellen : Calcium signaling and cytotoxicity of human natural killer cells

Abstract

Calcium signaling is an essential component of immune cell function. Immunocompetent cells employ calcium ions as a second messenger to regulate proliferation, migration and maturation. In addition, intracellular calcium signals are necessary for cytotoxic lymphocytes (CLs) such as CD8+ T-cells and natural killer cells (NK cells) to eliminate target cells. For several decades, the doctrine used to be that this elimination is mainly achieved by forcing a target cell into apoptosis. In recent years, several groups reported that there is at least one further way of target cell killing. Given the right circumstances, CLs are also able to kill by a direct lysis of the target cell’s membrane, a process referred to as ’necrosis’. Our research group, the Department of Biophysics at Saarland University, directed by Prof. Dr. Markus Hoth, investigates the Ca2+ dependence of signaling processes in immune cells. We found that calcium ion influx into killer cells is not only necessary for a successful attack on pathogens and tumor cells, but that extracellular calcium supply can influence a killer cell’s global killing efficiency. The aim of this doctoral thesis was to study influx kinetics of Ca2+ ions in active NK cells at a single-cell level using fluorescence microscopy. The conducted experiments led to two main conclusions: I) Not only do NK cells employ both necrosis and apoptosis when killing certain target cells, but the frequency distributions of both killing types depend highly on the extracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]ext). Low concentrations favor the occurrence of apoptosis, while an increase in [Ca2+]ext shifts the balance towards necrotic killing. This shift occurs even after raising Ca2+ ion levels beyond the amount necessary for necrosis induction. II) The shape of Ca2+ influx differs, regarding necrotic and apoptotic killing. Necrosis induction depends on high sustained rises in [Ca2+]int, while NK cells causing apoptosis tend to show low and oscillatory Ca2+ signals. Further experiments were conducted in attempt to reveal the responsible molecular mechanisms. Artificially releasing high amounts of Ca2+ ions into the cytosol of killing NK cells, using a photolabile Ca2+ chelator, suggests that high cytosolic Ca2+ concentrations are necessary but not sufficient for necrosis induction by NK cells. The presented results have contributed to shedding light on the Ca2+ dependence of NK cell function. In his doctoral thesis published in 2016, Christian Backes from our research group demonstrated that the balance of necrosis to apoptosis induced by NK cells greatly affects their total killing competence. The observation that global killing efficiency of CD8+ T-lymphocytes and NK cells depends on [Ca2+]ext can now in parts be explained by the likelihood of necrotic and apoptotic killing processes shifting. Although different Ca2+ influx patterns in active NK cells were previously described by other groups, no exact quantification of these signals has yet been provided. In addition to giving such a quantification, this thesis can provide evidence that these different signal types are clearly linked to distinct outcomes regarding NK cell cytotoxicity in vitro. NK cells play a pivotal role in tumor surveillance and - in case of already developed cancer - keeping malignant cell clones in check. Apoptosis and lysis of target cells may both help achieve a shared aim but will differently affect the anti-tumor immune response. Hence, different Ca2+ signals in tumor-killing NK cells as well as their likelihood of inducing apoptosis or necrosis may also affect tumor development, progression as well as the efficacy of immune therapy and adoptive cell transfer. Many recent studies suggest that tumor cells benefit from necrosis by taking advantage of the resulting microenvironment. If we can deepen our understanding of how different calcium signal types in CLs come about, we could try to modulate killing behaviour to shape a more desirable cellular immune response to malignancies.

Kalziumsignale spielen eine Schlüsselrolle in der Funktion unserer Immunabwehr. Immunzellen verwenden diese Signale, um komplexe Prozesse wie Proliferation, Migration und Reifung zu regulieren. Darüber hinaus benötigen Killerzellen wie CD8+-T-Zellen und natürliche Killerzellen (NK-Zellen) hohe zytosolische Kalziumspiegel, um Zielzellen abzutöten. Die Doktrin der letzten Jahrzehnte war, dass dieses Abtöten im Wesentlichen auf einem einzigen Mechanismus basiert: der Aktivierung des programmierten Zelltodes, der Apoptose der Zielzelle. Seit einiger Zeit mehren sich jedoch die Hinweise, dass es noch mindestens einen weiteren Mechanismus gibt. Unter gewissen Voraussetzungen können Killerzellen ihre Opfer auch durch eine direkte Lyse der Zellmembran töten. Dieser Prozess wird gemeinhin als "Nekrose" bezeichnet. Unter der Leitung von Prof. Dr. Markus Hoth erforscht unsere biophysikalische Arbeitsgruppe seit Jahren die Bedeutung von Kalziumsignalen für eine Vielzahl von Immunzellen. Wissenschaftler unserer Abteilung fanden heraus, dass ein Kalziumeinstrom in Killerzellen nicht nur notwendig für das Abtöten von Bakterien und Tumorzellen ist, sondern dass das extrazelluläre Kalziumionenangebot auch einen Einfluss auf die absolute Killingeffizienz ausübt. Das Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war, die Kinetik dieser Kalziumströme in aktiven NK-Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie auf Einzelzellebene zu erforschen. Die in diesem Rahmen durchgeführten Experimente lieferten zwei wichtige Erkenntnisse: I) Zusätzlich zur Bestätigung, dass NK-Zellen sowohl Apoptose als auch Nekrose in geeigneten Zielzellen induzieren, stellte sich heraus, dass die statistische Verteilung beider Killingtypen stark vom extrazellulären Kalziumangebot abhängt. Niedrige Konzentrationen an Kalziumionen begünstigen das Auftreten von Apoptosen, während steigende Kalziumspiegel zu mehr und mehr Nekrosen führen. Dieser Einfluss zeigt sich auch noch bei extrazellulären Kalziumkonzentrationen, die weit über dem für Nekrose notwendigen Maß liegen. II) NK-Zellen zeigen verschiedene Arten von Kalziumsignalen, je nachdem, welchen Typ Zytotoxizität (i.e. Nekrose oder Apoptose) sie in ihrer Zielzelle induzieren. Die Lyse der Zelle bedurfte dabei stets eines hohen und anhaltenden Einstroms von Kalziumionen, während Killerzellen, die Apoptose hervorriefen, niedrigere und oszillierende Kalziumströme zeigten. Weitere Experimente zielten darauf ab, die molekularen Mechanismen für diese Unterschiede in den Signalen aufzudecken. Indem große Mengen an Kalziumionen mittels eines photolabilen Chelators künstlich in Killerzellen freigesetzt wurden, konnte gezeigt werden, dass hohe Kalziumeinströme zwar notwendig, aber sehr wahrscheinlich nicht hinreichend für das nekrosebasierte Abtöten sind. Die vorliegenden Ergebnisse haben dazu beigetragen, die Kalziumabhängigkeit der Funktion von NK-Zellen besser zu verstehen. In seiner 2016 publizierten Doktorarbeit konnte Christian Backes aus unserer Arbeitsgruppe zeigen, dass die Balance von Nekrose- zu Apoptoseinduktion einen starken Einfluss auf das globale Killingpotential von NK-Zellen ausübt. Mit Hilfe der hier gewonnenen Erkenntnis, dass diese Balance vom extrazellulären Kalziumangebot abhängt, kann die Beeinflussung der Effizienz natürlicher Killerzellen durch die Verfügbarkeit von Kalziumionen nun in Teilen erklärt werden. Verschiedenartige Muster von Kalziumströmen in aktiven NK-Zellen wurden in der Vergangenheit bereits von anderen Arbeitsgruppen postuliert, jedoch nicht exakt quantifiziert. Neben einer solchen Quantifizierung kann die vorliegende Arbeit erstmals beweisen, dass diese Signalmuster deutlich mit den verschiedenen Killingarten assoziiert sind, zu denen NK-Zellen fähig sind. Natürliche Killerzellen zählen zu den wichtigsten Effektoren der Tumorüberwachung. Auch im Falle von bereits entstandenen Tumoren tragen sie essenziell dazu bei, den Tumor in Schach zu halten. Unmittelbar führen Apoptoseinduktion und Lyse zwar zum gleichen Ergebnis - dem Tod der Tumorzelle -, beide Prozesse beinflussen jedoch die gegen den Tumor gerichtete folgende Immunantwort auf stark unterschiedliche Weise. Es ist anzunehmen, dass die Frage, wie NK-Zellen Tumorzellen eliminieren und welche Kalziumsignale sie dabei präsentieren, auch einen Einfluss auf die Wirksamkeit von Chemotherapien, immunmodulierenden Therapien und adoptivem Zelltransfer haben könnte. Viele aktuelle Studien legen nahe, dass Tumorzellen von einem bestimmten immunologischen Mikromilieu profitieren. Ein solches Milieu scheint insbesondere durch nekrotische Zellen begünstigt zu werden. Ein tiefer gehendes Verständnis davon, wie verschiedene Kalziumsignale in NK-Zellen zustande kommen, könnte es erlauben, sie pharmakologisch zu beeinflussen, um das Tötungsverhalten von NK-Zellen zu modifizieren. Auf diese Weise könnte ein immunologisches Mikromilieu im Tumorgewebe erreicht werden, das bösartige Zellen schädigt, ohne gleichzeitig die Vermehrung benachbarter Tumorzellen zu stimulieren