Molekulare und funktionale Analyse von Lysin-Motiv-Rezeptor-ähnlichen Kinasen in P. × canescens

Abstract

Zur Gewinnung von Bioenergie werden Pappeln als Energieholz auf Kurzumtriebsplantagen (KUPs) angebaut. Während der Wachstumsphase sind die Pappeln biotischen und abiotischen Umwelteinflüssen ausgesetzt. Eine Reduktion der Biomasse kann bei schadhaften Umwelteinflüssen wie Pilzbefall oder Trockenstress die Folge sein. Ertragseinbußen von bis zu 50 % können durch den biotrophen Pilz Melampsora spec. verursacht werden. Andere biotische Einflüsse, wie beispielsweise mykorrhizierende Pilze, können einen positiven Effekt auf das Pflanzenwachstum, insbesondere in Stresssituationen haben. Die pflanzliche Immunantwort wird über pathogen-associated molecular patterns (PAMP) nach Erkennung von pilzlichem Chitin über Lysin-Motiv-Rezeptor-ähnliche Kinasen (LysM-RLKs) vermittelt. Insgesamt 19 LysM-RKLs wurden in der Pappel annotiert, von denen vier für Nod-Factor Perception“ (NFP)-ähnliche Gene kodieren, die mutmaßlich an der Ausbildung einer Symbiose mit mykorrhizierenden Pilzen involviert sind. Die orthologen Gene zu den gewählten NFP-like-Kandidatengenen in Pappel sind in Medicago truncatula und Lotus japonicus an der Ausbildung einer Symbiose mit Knöllchenbakterien beteiligt. Auf Grund der Genomduplikation der Pappel liegen die NFP-like-Kandidatengene in paralogen Paaren vor. In silico- und Real-Time PCR-Analysen zeigten, dass das Kandidatengen NFP-like2 in dem verwendeten P. × canescens-Klon nicht vorhanden ist. Anhand von Expressionsanalysen konnte bestätigt werden, dass NFP-like3 und NFP-like4 eine wurzelassoziierte Funktion aufweisen. Jedoch konnte eine Expression dieser Kandidatengene auch in Blattgewebe nachgewiesen werden. Die Analysen ergaben, dass NFP-like1 in den untersuchten Geweben so gering exprimiert ist, dass ihm mutmaßlich keine Funktion zukommt. Zur Modifikation der NFP-like-Kandidatengene wurden CRISPR/Cas9-Konstrukte erzeugt, die in beiden Genen eines paralogen Paares eine Modifikation hervorrufen können. Es konnten transgene Linien erzeugt werden, die eine Einzelmodifikation, Doppelmodifikationen und Dreifachmodifikationen in den Kandidatengenen aufwiesen. Molekulargenetische Analysen der generierten transgenen Linien wurden genutzt, um Kandidatenlinien für Mykorrhizierungs- und Infektionsversuche mit Melampsora spec. auszuwählen. Die Kandidatenlinien zeigten im durchgeführten Mykorrhizierungsversuch kein verändertes Mykorrhizierungsverhalten. Allerdings konnte für einzelne transgene Linien eine gesteigerte Resistenz gegenüber Melampsora spec. beobachtet werden.