Highly sensitive global phosphorylation analysis of complex biological samples using ERLIC in conjunction with LC-MS

Abstract

With the advent of mass spectrometry online coupled to liquid chromatography (LC-MS) as high-content-screening method for proteomes and phosphoproteomes of complex biological samples, quantification of thousands to ten thousands of proteins and protein phosphorylation events became possible. Whereas deep proteome analyses can nowadays be conducted with comparably low sample amounts < 50 µg (100,000 HeLa cells), deep phosphoproteomics still requires ~100-times more starting material to reach an appreciable depth. This is not only attributed to the sub-stoichiometric nature of protein phosphorylation events, but also to poor analyte recovery during sample processing – a critical problem for application in clinical and biomedical research, which is often restricted in sample material. The present work demonstrates the advantages of electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography (ERLIC) for phosphoproteomics with low sample amounts in the µg-range. ERLIC proved to allow for highly efficient phosphopeptide enrichment from proteolytic digests with trypsin or subtilisin (which proved superior for covering proline rich regions) and to exhibit 1.7-fold higher analyte recovery compared to the widely used TiO2-affinity enrichment. Unlike TiO2, which exhibits poor recovery for a substantial fraction of analytes, ERLIC does not alter the phosphopeptide stoichiometry. It further outperformed TiO2 in the detection of significantly regulated phosphorylation events (by means of p-values) from aliquots of a biological sample, namely cytomegalovirus (CMV) infected fibroblasts, but at the expense of increased LC-MS analysis time. In addition, ERLIC in conjunction with SIL-peptides and targeted LC-MS enabled the detection of a significant 3.5-fold downregulation of Ser125 phosphorylation on EGLN 1 (HIF1α-mediated hypoxia response) in cancerous tissue of ten colon cancer patients. In the second part, ERLIC was exploited for time-resolved deep proteomics and phosphoproteomics with minute amounts of murid cytomegalovirus (MCMV-) infected mouse fibroblasts (120 µg). MCMV serves as mouse model for human CMV (HCMV) infection, which is a major death cause of immunocompromised individuals and connected to sever neurological impairments of infants. The resulting dataset provided deep insight into the expression dynamics of 95 viral proteins and 142 viral protein phosphorylation events. 63 viral proteins were quantified with complete time-courses and classified according to expression profiles, which substantially differed from the traditional classification. Hierarchical clustering, functional enrichment analysis and pathway mapping of 6,618 mouse proteins and 2,311 phosphopeptides (complete time courses) revealed tremendous manipulation of the host cell. Reorganization of the host cell comprised (I) systematic shutdown of MAPK and TNFα signalling, DNA replication and programmed cell-death in parallel to (II) extensive upregulation of cellular resources for splicing, protein synthesis and vesicular transport to enable efficient viral replication. Subsequent comparison with published datasets on HCMV revealed a high degree of similarity on the level of cellular functions. However, the underlying molecular mechanisms significantly differed such as the fine-tuning of MAPK signalling shutdown, suppression of protease-mediated apoptosis and manipulation of cell cycle proteins including DNA replication. Hence, the results underscore the value of MCMV as mouse model for HCMV, but also unveiled pathways, which do not allow a transfer of findings. In summary, this work successfully demonstrates the strength of ERLIC as tool for sensitive phosphoproteomics and its successful application to study viral infection in fibroblast cells with low sample amounts in the µg-range.

Mit dem Einzug der Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung (LC-MS) als High-Content-Screening-Methode für die Proteom- und Phosphoproteomanalyse komplexer biologischer Proben ist eine Quantifizierung von Tausend oder Zehntausend Proteinen und Proteinphosphorylierungen möglich geworden. Während umfassende Proteomanalysen mit vergleichsweise geringen Probenmengen < 50 µg (100,000 HeLa Zellen) durchgeführt werden können, wird für eine umfassende Phosphoproteomanalyse immer noch ~100-mal mehr benötigt – nicht nur wegen der substöchiometrischen Natur der Proteinphosphorylierungen, sondern auch wegen der schlechten Wiederfindungsrate der Analyten in der Probenvorbereitung. Dies ist ein wesentliches Problem für die Anwendung in der klinischen und biomedizinischen Forschung, welche oft mit niedrigen Probenmengen durchgeführt wird. Der erste Teil dieser Arbeit zeigt die Vorteile der Elektrostatische Repulsions-Hydrophile Interaktions-Chromatographie (ERLIC) für die Phosphoproteomanalysen mit geringen Probenmengen. Durch eine Reihe methodischer Experimente wurde gezeigt, dass ERLIC eine effiziente Anreicherung von Phosphopeptiden aus proteolytischen Verdauen mit Trypsin oder auch Subtilisin (welches nachweislich prolinreiche Regionen besser abdeckt) ermöglicht und eine 1,7-fach verbesserte Wiederfindungsrate aufweist als die vielverwendete TiO2-Affinitätsanreicherung. Im Gegensatz zu TiO2, welches für einen wesentlichen Teil an Analyten schlechte Wiederfindungsraten zeigt, bleibt die Stöchiometrie der Analyten bei ERLIC unverändert. Weiterhin ermöglicht ERLIC (im Vergleich zu TiO2) eine verbesserte Detektion differentiell regulierter Proteinphosphorylierungen, was mit identischen Aliquots einer biologischen Probe gezeigt wurde, nämlich Cytomegalovirus- (CMV-) infizierter Fibroblastenzellen aber auf Kosten höherer LC-MS Analysezeiten. Ebenfalls erlaubte ERLIC die gezielte Anreicherung eines spezifischen Phosphopeptids aus gesundem und erkranktem Gewebe von zehn Kolonkarzinompatienten. Dabei wurde unter Verwendung von SIL-Peptiden und targeted LC-MS eine signifikante, 3,5 fache Verringerung der Ser125 Phosphorylierung an EGLN-1 im Krebsgewebe nachgewiesen. Im zweiten Teil wurde mittels ERLIC eine umfassende und zeitaufgelöste Analyse des Proteoms und Phosphoproteoms mit geringen Mengen (120 µg) mauscytomegalovirus- (MCMV-) infizierter Fibroblasten durchgeführt – dabei handelt es sich um das Mausmodell für das humane CMV (HCMV), welches eine Haupttodesursache für immunsupprimierte Menschen ist und schwere Geburtsschäden an Neugeborenen hervorruft. Der Datensatz gibt tiefe Einblicke in die Dynamik der Expression 95 viraler Proteine und 142 viral Proteinphosphorylierung. Für 63 virale Proteine wurde ein vollständiges Expressionsprofil erstellt, was eine Klassifizierung ermöglichte, die sich wesentlich von der traditionellen Klassifizierung unterscheidet. Hierarchische Clustering-, Functional Enrichment- und Pathway-Analysen von 6,618 mouse proteinen und 2,311 phosphopeptiden (vollständiges Zeitprofil) deckten eine erhebliche Manipulation der Wirtszelle auf. Diese umfasst (I) die Unterdrückung des MAPK- und TNFα- Signalwegs, der DNA-Replikation und den programmierten Zelltod, parallel zur (II) Hochregulation zellulärer Ressourcen für das Spleißen, die Proteinsynthese und den intrazellulären Transport um eine effiziente Virusreplikation zu ermöglichen. Ein Vergleich mit publizierten Daten zu HCMV-infektion zeigte, dass die Manipulationen auf Ebene der Zellfunktionen sehr ähnlich sind, aber dass es auf molekular Ebene wesentliche Unterschiede gibt, wie bei der Feinabstimmung der MAPK-Signalunterdrückung, der Unterdrückung Protease-abhängiger Apoptose und der Manipulation von Proteinen des Zellzyklus und der DNA-Replikation. Die Ergebnisse unterstreichen somit den Wert von MCMV als Mausmodell für HCMV, deuten aber auch auf Signal- und Stoffwechselwege, die keinen direkten Erkenntnistransfer erlauben. Zusammengefasst: Die Arbeit demonstriert die Vorteile von ERLIC für die sensitive Phosphoproteomanalyse und ihren Einsatz zur Analyse viraler Infektion in Fibroblastenzellen mit geringen Probenmenge im µg-Bereich.