Identification and characterization of secreted stage-related proteins from the nematode Strongyloides ratti with putative relevance for parasite-host relationship: small heat shock proteins 17 and a homologue of the macrophage migration inhibitory factor

Abstract

A wide range of biomolecules, including proteins, are excreted/secreted from helminths that contribute to parasites’ successful establishment, survival and reproduction in an adverse habitat. Excretory/secretory proteins are active at the interface between parasite and host comprising potential targets for intervention. The intestinal nematode Strongyloides spp. exhibits an exceptional developmental plasticity in its life cycle characterized by parasitic and free-living generations. This parasite is therefore a good candidate for the exploration of parasite-host-relationships. In the present study the differential expression of genes encoding the excretory/secretory proteins has been investigated by quantitative RT-PCR from infective larvae (iL3), parasitic females (PF) and free-living females (FF) of the rat parasite Strongyloides ratti, genetically very similar to the human pathogen Strongyloides stercoralis. This study confirms the previous proteomic analysis of the stage-specific ESP from S. ratti (http://www.chemie.uni-hamburg.de/bibliothek/2009/DissertationSoblik.pdf). The selected 19 genes from the investigated stages analysed in qRT-PCR included proteases, heat shock proteins, carbohydrate-binding proteins and a cytokine homologue. The stage-related transcripts comprised: (i) iL3: an astacin metalloproteinase, carbohydrate-binding proteins and a homologue of the human cytokine macrophage migration inhibitory factor (ii) PF: a prolyl oligopeptidase, small heat shock proteins and carbohydrate-binding proteins (iii) FF: a lysozyme family member and carbohydrate-binding proteins In search of proteins involved in the interaction of intestinal nematodes with the mammalian mucosal host cells, two small Sr-HSPs secreted by PF were investigated. The full-length gene sequences of Sr-HSP17a (cDNAs - 483 bp ; ~19 kDa) and Sr-HSP17b (cDNAs - 474 bp; ~18 kDa) were identified showing 49% amino acid identity and the genomic organization was analysed. The analysis of DNA and amino acid sequences showed that the two genes share a conserved alpha-crystallin domain and a variable N-terminus. The Sr-HSP17 proteins displayed the highest homology to the deduced small heat shock protein of the human parasite S. stercoralis. For further characterization, the proteins were recombinantly expressed and purified. We observed a strong immunogenicity of both proteins leading to high IgG responses following infection or immunization of rats. By applying the purified polyclonal antibodies, both native Sr-HSP17s could be detected in the extract as well as the E/S products from PF, confirming their stage-associated expression. Flow cytometry analysis indicated the inhibitable binding of Sr-HSP17s to the monocytes/macrophage lineage but neither to peripheral lymphocytes nor neutrophils. A rat intestinal epithelial cell line also, showed dose-dependent binding of Sr-HSP17a but not of Sr-HSP17b. Exposed monocytes released IL-10 but not TNF-alpha in response to Sr-HSP17s, suggesting a possible involvement of the secreted female proteins in local host immune responses. In addition, the 13.5 kDa S. ratti homologue of the human cytokine macrophage migration inhibitory factor (MIF) was characterized as primarily secreted from iL3 - while the transcript was also found at lower levels in parasitic and free-living females. The full-length 372 bp-cDNA was identified and the gene structure analyzed. Again, the sequence analysis showed the highest homology to the human pathogen S. stercoralis and both are related to the nematode MIF type-2. The recombinantly expressed and purified Sr-MIF exhibited no in vitro tautomerase activity. The exposure of Sr-MIF to the host immune system is indicated by demonstration of high IgG reactivities in hosts’ sera following infection or immunization. Flow cytometry analysis revealed the inhibitable binding of Sr-MIF to the monocytes/ macrophage lineage but not to peripheral lymphocytes. After exposure to Sr-MIF, monocytes released significant levels of IL-10 but not TNF-alpha suggesting the involvement of the secreted parasite MIF in host immune responses. In the present work two Strongyloides small heat shock proteins (Sr-HSP17s) and a cytokine homologue (Sr-MIF) have been identified, molecularly characterized and analyzed for their biological activity. The release of the small HSPs from PF into the host’s intestine suggests their link to the mucosal host immune defense system. Further, the release of the MIF from iL3 may suggest a possible role of the Sr-MIF in their survival after invasion into host tissues. The exposure of Sr-HSP17s and Sr-MIF to the host’s environment, verified by humoral and cellular reactions, displays their involvement in local parasite-host-interactions, improving their establishment and evasion mechanisms or contributing to immunomodulation and intestinal homeostasis.

Eine große Anzahl von Biomolekülen, darunter viele Proteine, werden von Helminthen freigesetzt und tragen zur erfolgreichen Etablierung der Parasiten, zu deren Überleben und Vermehrung in einem zum Teil ungünstigen Lebensraum bei. Exkretorisch/sekretorische (E/S) Proteine wirken an der Interphase zwischen Parasit und Wirt und stellen potenzielle Ziele für eine Intervention dar. Der intestinale Nematode Strongyloides spp. weist eine außergewöhnliche Plastizität in seinem Lebenszyklus auf, der parasitisch und frei lebende Generationen umfasst. Dieser Parasit ist daher besonders gut geeignet, für die parasitische Lebensweise relevante Moleküle und das Wirtssystem beeinflussende Moleküle zu identifizieren. In der vorliegenden Studie wurde zunächst die differentielle Expression von Genen, die exkretorisch/sekretorische Proteine kodieren, mit Hilfe der quantitativen RT-PCR untersucht. Dabei wurden Transkripte von infektiösen Larven (iL3), parasitären Weibchen (PW) und frei lebenden Weibchen (FW) des Rattenparasiten Strongyloides ratti analysiert, der ein genetisch nahverwandter Nematode des menschlichen Parasiten Strongyloides stercoralis ist. Diese Ergebnisse bestätigten die frühere Proteomanalyse der Arbeitsgruppe über stadien-spezifischen E/S Proteine von S. ratti (http://www.chemie.uni-hamburg.de/bibliothek/2009 /DissertationSoblik.pdf). Die ausgewählten 19 Gene der untersuchten Stadien, die in der quantitativen RT-PCR analysiert wurden, waren: (i) iL3: eine Astacin Metalloproteinase, Kohlenhydrat-bindende Proteine, ein Homolog des menschlichen Zytokins Makrophagen-Migrations-Inhibitionsfaktor (ii) PW: eine Prolyloligopeptidase, kleine Hitzeschockproteine und Kohlenhydrat-bindende Proteine (iii) FW: ein Protein der Lysozymfamilie und Kohlenhydrat-bindende Proteine Im Rahmen der Untersuchungen über Strongyloides-Proteine, die von parasitären Weibchen im Darm freigesetzt werden, wurden weiterhin zwei kleine Hitzeschockproteine nachgewiesen. Die vollständigen Gensequenzen von Sr-HSP17a (cDNAs - 483 bp; ~19 kDa) und Sr-HSP17b (cDNAs - 474 bp; ~ 18 kDa) wurden identifiziert und zeigten eine 49% Übereinstimmung in der Aminosäuresequenz. Die genomische Organisation der Gene wurde analysiert. Beide Gene wiesen eine konservierte alpha-Kristallindomäne und einen variablen N-Terminus auf. Die Sr-HSP17-Proteine zeigten die höchste Homologie mit der abgeleiteten Hitzeschockproteinsequenz von S. stercoralis. Zur weiteren Charakterisierung wurden die HSPs rekombinant exprimiert und gereinigt. Nach Infektion sowie nach Immunisierung von Ratten liess sich eine starke Immunogenität beider Proteine feststellen. Mit Hilfe gereinigter polyklonaler Antikörper konnten die nativen HSP17a,b-Proteine in Extrakten sowie E/S-Produkten von PW nachgewiesen werden und deren Stadienassoziation bestätigt werden. Durchflusszytometrische Analysen zeigten eine hemmbare Bindung von Sr-HSP17s an Monozyten/Makrophagen, jedoch keine Bindung an Lymphozyten oder neutrophile Granulozyten. Erstmalig konnte eine dosisabhängige Bindung von Sr-HSP17a, aber nicht von Sr-HSP17b an Epithelzellen des Rattendünndarms nachgewiesen werden. Sr-HSP17-exponierte Monozyten setzten außerdem das immunsuppressiv wirkende Zytokin IL-10 aber nicht das inflammatorische Zytokin TNF-alpha frei, was auf eine mögliche Wirkung des sekretierten Proteins bei lokalen Immunantworten hinweist. In der vorliegenden Studie wurde weiterhin ein 13,5 kDa Homolog des Zytokins Makrophagen-Migrations-Inhibitionsfaktor (MIF) von S. ratti charakterisiert, der vor allem von iL3 freigesetzt wird, dessen Transkript auch in geringem Ausmaß in parasitären und frei lebende Weibchen nachweisbar war. Die komplette 372 bp cDNA wurde identifiziert und die Genstruktur analysiert. Die Sequenzanalyse zeigte erneut die höchste Homologie zu dem humanpathogenen S. stercoralis. Das rekombinant exprimierte und aufgereinigt Sr-MIF-Protein wies keine in vitro Tautomeraseaktivität auf. Eine Wirkung von Sr-MIF auf das Immunsystem des Wirtes zeigte sich an hohen IgG-Titern infizierter oder immunisierter Tiere. Durchflusszytometrische Analysen ergaben, daß Sr-MIF an Monozyten/Makrophagen nicht aber an Lymphozyten bindet. Sr-MIF induzierte die Freisetzung von IL-10 aber kaum von TNF-alpha aus peripheren Monozyten, was auf eine Wirkung des sekretierten Proteins auf das Wirtsimmunsystem hinweist. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Hitzeschockproteine (Sr-HSP17s) und ein Zytokinhomolog, der Makrophagen-Migrations-Inhibitionsfaktor (Sr-MIF), molekular charakterisiert und eine Analyse ihrer biologischen Aktivität initiiert. Die Freisetzung der HSPs aus PW in den Dünndarm wie des Zytokinhomologs aus iL3 im Gewebe, deren Interaktion mit Zellen des natürlichen Abwehrsystems sowie die Bildung spezifischer Antikörper gegen die Parasitenproteine lassen deren Einfluß auf das intestinale mukosale Immunsystem bzw. das Gewebe annehmen, in das die iL3 eindringen, wobei sie möglicherweise beteiligt sind, die Etablierung der Parasitenstadien und deren Evasion zu fördern sowie möglicherweise auch zur lokalen Immunmodulation beitragen und die Homöostase der Gewebe beeinflussen.