Genetische und biochemische Analysen zur Funktion des viralen Proteins E4orf3/4 im lytischen Replikationszyklus vom humanen Adenovirus Typ 5

Abstract

Die frühe Transkriptionseinheit 4 (E4) humaner Adenoviren kodiert für mindestens sechs verschiedene Polypeptide, die entsprechend der Reihenfolge und Anordnung ihrer offenen Leserahmen (open reading frame, orf), als E4orf1, E4orf2, E4orf3, E4orf4, E4orf6 und E4orf6/7 bezeichnet werden. Außerdem wird die Existenz eines weiteren Genproduktes (E4orf3/4) vermutet, da in Adenovirus-infizierten Zellen ein alternativ prozessiertes Fusionstranskript der offenen Leserahmen 3 und 4 (orf3/4) nachgewiesen werden kann. Der abgeleitete Leserahmen von 3/4 kodiert für ein 61 Aminosäurereste (AS) langes Polypeptid, das ein theoretisches Molekulargewicht von 7,2 kDa besitzt und sich aus amino- und carboxyterminalen Bereichen der E4orf3- (33 AS) bzw. E4orf4-Proteine (28 AS) zusammensetzt. Es wird diskutiert, dass E4orf3/4 aufgrund dieser Gemeinsamkeiten redundante Funktionen mit beiden E4-Proteinen besitzt. Die vorliegende Arbeit befasste sich mit Untersuchungen zur Expression des E4orf3/4-Gens. Primäres Ziel dieser Analysen war es, das E4orf3/4-Protein in Adenovirus-infizierten Zellen nachzuweisen und seine Rolle im lytischen Infektionszyklus aufzuklären. Mit Hilfe genetischer und biochemischer Analysen konnte erstmals die Existenz des Fusionsproteins E4orf3/4 in virusinfizierten Zellen bestätigt werden. E4orf3/4 ist ein zytoplasmatisches Protein, das in Western Blot-Analysen entsprechend seinem theoretischen Molekulargewicht bei ca. 7 kDa nachgewiesen werden kann. Das virale Protein besitzt eine extrem kurze Halbwertszeit (ca. 14 min), was auf wichtige regulatorische Funktionen im viralen Replikationszyklus hinweist. In Übereinstimmung dazu zeigen genetische Analysen verschiedener E4-Virusmutanten (E4orf3-, E4orf4-, E4orf3/4-, E4orf3- 4- und E4orf3- 4- 3/4-), dass E4orf3/4 eine zentrale Rolle beim Übergang von der frühen in die späte Phase der Virusreplikation spielt. Wahrscheinlich reguliert das virale E4-Protein diese Vorgänge über eine intrinsische nukleo-zytoplasmatische Pendelfunktion und über die Wechselwirkung mit zellulären Faktoren der DNA-Synthese. An erster Stelle steht dabei das zelluläre Protein PCNA, das im Rahmen einer Interaktionssuche mit Hilfe des Hefe-Zwei-Hybridsystems als Bindungspartner identifiziert werden konnte. PCNA ist ein Prozessivitätsfaktor für diverse zelluläre DNA-Polymerasen und ist auch an Vorgängen der DNA-Schadensantwort der Wirtszelle beteiligt. Analog zu E4orf3 besitzt E4orf3/4 onkogene Eigenschaften, da das virale Protein in Kooperation mit den E1A-Onkoproteinen die Transformation primärer Rattenepithelzellen einleiten und in Kombination mit E1A plus E1B die Effizienz der Transformationsinitiation deutlich steigern kann. Ob diese Aktivitäten über die nukleo-zytoplasmatische Pendelfunktion und/oder Wechselwirkung mit PCNA vermittelt werden müssen weitere Untersuchungen klären. Insgesamt bestätigen die vorliegenden Ergebnisse erstmals, dass die E4-Region humaner Adenoviren ein Fusionsprotein der offenen Leserahmen 3 und 4 kodiert. E4orf3/4 ist ein regulatorisches Polypeptid das eine wichtige Rolle in der Steuerung des viralen Replikationszyklus spielt. Zusammen mit E4orf3 und E4orf6 ist E4orf3/4 das dritte Protein der E4-Region, das in die Vorgänge der DNA-Synthese und DNA-Reparatur eingreift und onkogene Eigenschaften besitzt. Diesen Aktivitäten liegen offenbar neue molekulare Wirkmechanismen zugrunde, die vermutlich eng mit der Wechselwirkung mit PCNA verknüpft sind.

Human adenovirus early region 4 (E4) encodes at least six distinct polypeptides, defined as E4orf1 to E4orf6/7 according to the order and arrangement of the corresponding open reading frames (orfs). E4 gene products operate through a complex network of protein interactions with key viral and cellular regulatory components involved in transcription (E4orf6/7), apoptosis, cell cycle control and DNA repair (E4orf6), as well as host cell factors that regulate cell signalling (E4orf1), posttranslational modifications (E4orf4) and the integrity of PML-containing nuclear bodies (E4orf3). As part of our studies of E4 function we generated a set of mutant viruses carrying point mutations in the E4 genes. The phenotypic characterization of these mutants revealed that lesions affecting individual orfs had no or only moderate effects on lytic virus growth. By contrast, Ad mutants that lack the entire E4 region or fail to express the E4orf6 protein were severely restricted for growth. Unexpectedly, a virus mutant unable to express E4orf3 plus E4orf4 was as defective as the E4-minus and E4orf6 mutant viruses. Further, more detailed genetic and biochemical analyses demonstrated that the E4orf3/E4orf4 double mutant exhibits a pleiotropic phenotype and fails to produce the E4orf3/4 fusion protein, which consists of the N-terminal 33 amino acid residues from orf3 and the C-terminal 28 amino acid residues from orf4. Consistent with this a virus mutant lacking E4orf3/4 and E4orf4 replicated to levels nearly equally reduced to the E4-minus mutant. In sum, these results introduce a function for E4orf3/4 and suggest that E4orf3/4 and E4orf4 provide redundant functions for efficient viral replication, which is intimately linked to their identical C-terminal regions.