In vitro culture of Camptotheca acuminata (Decaisne) in Temporary Immersion System (TIS): Growth, development and production of secondary metabolites

Abstract

Camptothecin (CPT) and its analogue 10-hydroxycamptothecin (HCPT) are two naturally occurring monoterpene indole alkaloids in Camptotheca acuminata. Both, CPT and HCPT show potential efficacy as anticancer and antiviral agents. Currently, there is a high demand for CPT and commercial nurseries cannot meet the demand for CPT production. Therefore, the production of these compounds relies primarily on natural grown plants, which is the main reason that C. acuminata is facing a steep decimation in its population. Thus, an efficient and reliable micropropagation protocol would aid Camptotheca’s conservation and at the same time would be a sustainable source for the production of CPT. This thesis has evolved from the profound knowledge of C. acuminata. The key objective of this study was to investigate the growth, development and production of secondary metabolites of C. acuminata, using the Temporary Immersion System (TIS). Shoots were cultured in two different TIS vessels, DVS and RITA®. In the course of this study the following results were achieved. Ex situ germination of shortly stored seeds ranged from 60 to 80%, while fresh seeds did not germinate. Conversely, in vitro seeds germination raised up to 100% after pericarp and endosperm were removed. Whereas stem cuttings cultured ex situ in a mixture of soil, sand and vermiculite showed a rooting and survival rate of 32 to 38% regardless of the seasons. Multiple shoots were successfully initiated in vitro from one-year-old greenhouse plants via axillary buds. Each nodal explant produced one shoot but when this shoot was excised and subcultured on MS medium supplemented with 0.5, 1.0 and 1.5 mg l-1 BAP, an average of 7.3, 9.8 and 16.8 shoots per explant were obtained, respectively.

Plant regeneration via organogenesis from matured zygotic embryos and seedlings hypocotyl have been established in both solid and liquid media. Shoot bud formation occurred on radicle, hypocotyl, apical tip and cotyledon explants cultured on MS medium containing high cytokinins (BAP, Kin, 2iP) and low auxins (NAA, 2,4-D and IAA). An average of 17 buds was scored per callus derived from apical tips and 10 buds among calli derived from cotyledons, hypocotyls and radicles. The best shoot bud formation occurred on 2 mg l-1 BAP plus 0.1 mg l-1 IAA.

Somatic embryogenesis was induced on hypocotyl segments from 14-day-old in vitro seedlings in MS medium containing 35 g l-1 sucrose devoid PGR after 16 weeks of incubation in both the DVS and RITA® vessels. Embryo maturation was extremely slow in TIS but when plated on the same solid PGR-free medium, proembryos matured into well-developed cotyledonary embryos within four weeks. Cotyledonary embryos were selected and re-cultured in MS medium supplemented with 0.5 mg l-1 BAP in TIS for plantlet conversion. Plant conversion via somatic embryos was successfully achieved in TIS and in sterilised substrates moistened with 0.5 mg l-1 BAP.

Shoot multiplication and in vitro rooting of C. acuminata was successfully achieved in solid medium and in TIS.

o After eight weeks in culture a multiplication rate of 7 shoots per explant was obtained in solid MS medium supplemented with 0.5 and 1.0 mg l-1 BAP and 9 shoots per explant with 1.5 mg l-1 BAP. Shoots cultured with 0.5 mg l-1 BAP showed the best quality.

o Shoot multiplication rate in TIS was influenced by the BAP concentration and the immersion cycles. Shoots cultured in MS medium supplemented with 1.0 and 1.5 mg l-1 BAP showed the highest multiplication rate in both DVS (23 ± 3.1, 29 ± 3.0) and RITA® vessels (14 ± 2.8, 20 ± 4.9) respectively, but hyperhydricity and callus formation was obvious, especially on explants in RITA®. The best results on shoot growth and multiplication rate in TIS was achieved with 0.5 mg l-1 BAP. However, shoot proliferation in DVS was distinctly affected by the one minute immersion cycles (IC) 4 and 8 times daily (d-1). The highest shoot multiplication rate scored in DVS was 20 and 13 shoots per explant after eight weeks at 4 and 8 IC d-1, respectively. Shoots grown in RITA® were not affected by the IC. An average of 15 shoots per explant was scored in both IC treatments. Shoot height and fresh weight was also not affected by the different IC treatments. o In vitro rooting of microshoots was more successful with IBA in both solid medium and in TIS than with NAA. The two auxins had no effect on the in vitro rooting on sterilised substrates. Rooting percentage with 0.5 IBA was 90% in DVS, 92% in RITA®, 81% in solid medium, while those on the different sterilised substrates ranged from 60 to 92%. Root induction with NAA was less effective. Ex vitro rooting on non-sterile substrates ranged form 27 to 46%.

o The highest survival rate under greenhouse conditions was recorded on plantlets derived from sterilised substrates with 93% followed by those derived from RITA® with 47%, solid medium with 45% and from DVS with 41%.

In vitro cell, tissue and organ cultures of C. acuminata were examined for their variation of camptothecin (CPT) and 10-hydroxycamptothecin (HCPT) content. Quantification was carried out on undifferentiated and differentiated cultures grown in TIS and in solid medium. CPT accumulation was also detected in liquid culture media. Among the in vitro cultures the highest amount of CPT was found in individual genotypes grown in TIS and in solid medium with an average of 2.5 and 2.2 mg g-1 DW, respectively. The maximum CPT content found in ex vitro seedlings ranged from 2.3 to 4.8 mg g-1 DW and in in vitro grown seedlings from 4.1 to 4.5 mg g-1 DW. Cotyledonary embryos and regenerated plantlets were marked with 0.87 and 1.23 mg g-1 DW, respectively. CPT excretion in liquid media at 8 IC d-1 was about 6 µg g-1 FW in RITA® (0.048 mg l-1) and 12.6 µg g-1 FW in DVS (0.193 mg l-1).

Camptotheca acuminata (Decne) (Xi Shu, der Glücksbaum) gehört zu den Laubbäumen der Familie Nyssaceae (Cornales, Hartriegelgewächse) und ist der einzige Vertreter seiner Gattung. C. acuminata wurde während einer systematischen Prüfung chinesischer Arzneipflanzen vom United States Department of Agriculture (USDA) in den fünfziger Jahren entdeckt. Es hat sich herausgestellt, daß sowohl aus den Blättern als auch aus Früchten, Samen, Rinden und Zweigen verschiedene Indolalkaloide isoliert werden können, darunter Camptothecin (CPT). CPT ist ein Anti-Krebs-Wirkstoff, der zur Behandlung von Lungen- Eierstock-, und kolorektalem Krebs verwendet wird. Aufgrund einer weltweit stetig steigenden Nachfrage für CPT, wird C. acuminata durch Wildsammlungen derart ausgebeutet, daß die Art inzwischen vom Aussterben bedroht ist. Auch kommerzielle Baumschulen sind noch nicht in der Lage diesen Bedarf zu decken und den Raubbau zu verhindern. Vor dem Hintergrund, daß C. acuminata vom Aussterben bedroht ist und die Nachfrage für den Rohstoff CPT jedoch kontinuierlich steigt, sollte in der vorliegenden Arbeit ein zuverlässiges Protokoll zur in vitro Vermehrung von C. acuminata erstellt werden, sodaß in einem weiteren Schritt sowohl die Produktion von neuen Pflanzen als auch die Gewinnung des Rohstoffs CPT gewährleistet werden kann. Eines der Hauptziele dieser Arbeit war die in vitro Kultivierung von C. acuminata im Temporary Immersion System (TIS), um das Wachstum und die Entwicklung der Pflanzen und damit die Produktion des Sekundärstoffes CPT zu optimieren. Zusätzlich zu der in vitro Kultivierung wurde die konventionelle Methode angewendet, C. acuminata im Gewächshaus zu vermehren. In der vorliegenden Arbeit wurden folgende Ergebnisse erzielt. • Die ex situ Keimung kurz gelagerter C. acuminata Saaten zeigte im Gewächshaus eine Keimrate von 60 bis 80%, während frisch geerntetes Saatgut nicht keimte. Im Gegensatz dazu wurde in vitro eine Keimrate bis zu 100% erzielt, dies jedoch erst nach Entfernung von Perikarp und Endosperm. • Eine Stecklingvermehrung in einer Substratmischung von Quarzsand, Erde und Vermiculit zeigte im Gewächshaus, unabhängig von der Jahreszeit eine Überlebensrate von nur 32-38%. Parallel hierzu konnte eine in vitro Vermehrung von einjährigen Gewächshaus-Pflanzen erfolgreich etabliert werden. Aus jedem Sproßabschnitt entwickelte sich jeweils nur ein Sproß. Nach Abschneiden und Umsetzen dieser Sprosse auf MS Medium unter Zusatz von 0,5; 1,0 and 1,5 mg l-1 BAP, wurden pro Explantat im Mittel 7,3; 9,8 bzw. 16,8 neue Sprosse gebildet. • Aus reifen zygotischen Embryonen und verschiedenen Keimlingsabschnitten wurden über den Weg der Organogenese und somatischen Embryogenese, Pflanzen erfolgreich regeneriert. Organogenese wurde bei verschiedenen Keimlingsexplantaten, sowohl auf festem als auch in flüssigem MS Medium mit hohen Cytokinin- (BAP, Kin, 2iP) und niedrigen Auxinkonzentrationen (NAA, 2,4-D, IAA) erreicht. Es wurden bis zu 17 Knospen am Kallusgewebe von Apikalmeristemen gebildet und im Mittel 10 Knospen am Kallusgewebe von Kotyledonen, Hypocotylen und Wurzeln. Die meisten Knospen wurden bei einer Cytokinin-Auxinkombination von 2 mg l-1 BAP und 0,1 mg l-1 IAA gebildet. Die Induktion somatischer Embryogenese wurde an Hypocotylexplantaten nur im TIS in phytohormon-freiem MS Medium mit 35 g l-1 Saccharose erfolgreich induziert. Die Maturation somatischer Embryonen verlief jedoch sehr langsam. Eine Ausplattierung auf phytohormon-freies Festmedium (Agar) mit 35 g l-1 Saccharose führte innerhalb von vier Wochen zu gut ausgebildeten Kotyledon-Embryonen. Diese Embryonen wurden entnommen und im TIS zur Pflanzenregeneration weiter kultiviert. Die Pflanzenregeneration mittels somatischer Embryogenese war erfolgreich im TIS und auf sterilen Substraten, die mit 0,5 mg l-1 BAP-haltigem MS-Medium befeuchtet wurden. • Die in vitro Sprossvermehrung und Bewurzelung von C. acuminata war sowohl auf Agar-Medium als auch im TIS in zwei verschiedenen Kulturgefäßen (DVS und RITA®) erfolgreich. o Bei Zugabe von 0,5 bzw. 1,0 mg l-1 BAP wurde auf Agar-Medium nach acht Wochen eine 7 fache Sprossvermehrung erzielt und eine 9 fache Rate bei Zugabe von 1,5 mg l-1 BAP. Die mit 0,5 mg l-1 BAP kultivierten Sprosse waren jedoch von deutlich besserer Qualität. o Die Sprossvermehrung im TIS wurde durch die BAP- Konzentrationen und die Anzahl der Flutungen pro Tag beeinflußt. Die höchste Vermehrungsrate wurde im MS-Medium mit 1,0 bzw. 1,5 mg l-1 BAP erreicht. Bei 4 Flutungen pro Tag wurden im DVS 23 ± 3,1 bzw. 29 ± 3,0 und im RITA® 14 ± 2,8 bzw. 20 ± 4,9 Sprosse pro Explant gebildet. Diese Sprosse waren jedoch von schlechter Qualität, besonders im RITA® zeigten sich die Pflanzen glasig und neigten zur Kallusbildung. Die besten Ergebnisse beim Sprosswachstum, sowie bei der Vermehrungsrate wurden im TIS mit 0,5 mg l-1 BAP erzielt. o Die höchste Vermehrungsrate in DVS war 20 fach bei 4 Flutungen und 13 fach bei 8 Flutungen pro Tag, während im RITA® die Vermehrungsrate nur 15 fach war. Im Gegensatz zum DVS wurde im RITA® die Vermehrungsrate nicht durch die Flutungshäufigkeiten beeinflußt. Die Sprossgröße und das Frischgewicht waren im TIS flutungsunabhängig. o Bei der in vitro Bewurzelung von Microsprossen wurden mit IBA, sowohl auf Agar-Medium als auch im TIS bessere Ergebnisse erzielt als mit NAA. Im Vergleich zu Fest- und Flüssigkulturen hatte die Verwendung von IBA und NAA für die in vitro Bewurzelung auf sterilen Substraten keinen Einfluß. Die Bewurzelung betrug mit 0,5 mg l-1 IBA im RITA® 92%, im DVS 90%, auf Agar-Medium 81% und auf den verschiedenen sterilen Substraten 60 bis 92%. Die ex vitro Bewurzelung betrug bei nicht sterilen Substraten 27 und 46%.

• Die höchste Überlebensrate unter ex vitro Bedingungen zeigten in vitro bewurzelte Pflanzen, die aus sterilen Substraten stammten ( 93%), gefolgt mit 47% aus RITA®, 45% aus Agar-Medium und 41% aus dem DVS.

• Die Sekundärstoffe Camptothecin (CPT) und 10-Hydroxycamptothecin (HCPT) wurden mittels der HPLC-Analyse an verschiedenen C. acuminata Pflanzengeweben bestimmt. Die in vitro Pflanzen zeigten ein unterschiedliches Verteilungsmuster der CPT- und HCPT-Anreicherung. Im allgemeinen hat sich herausgestellt, daß die Inhaltstoffe genotypisch- und von den Kulturbedingungen abhängig waren. Der höchste CPT-Gehalt auf das Trockengewicht (TG) bezogen lag zwischen 2,5 mg g-1 für in TIS kultivierte Sprosse, und bei 2,2 mg g-1 für Kulturen auf Agar-Medium. Der maximale CPT-Gehalt betrug bei den ex situ Sämlingen 2,3 bis 4,8 mg g-1 TG und bei den in vitro Pflänzchen 4,1 bis 4,5 mg g-1 TG. Eine große CPT- Variation wurden bei den verschiedenen Kalli und somatischen Embyronen festgestellt. Der höchste CPT-Gehalt wurde mit 0,87 mg g-1 TG in den Kotyledonen-Embryonen und mit 1,23 mg g-1 TG bei den regenerierten Pflänzchen bestimmt. Hohe HCPT-Gehalte kamem nur in den Hypokotylen der ex situ Sämlinge vor. Die in vitro Sämlinge enthielten sehr wenig bzw. kein HCPT. Die höchste CPT-Absonderung aus den Pflanzenkulturen in das Nährmedium wurde bei 8 Flutungen pro Tag in beiden Systemen gemessen, und zwar im RITA® mit 6 µg g-1 FG gefolgt von 12,6 µg g-1 FG im DVS.