Untersuchungen zur funktionellen Bedeutung der direkten Bindung von Calmodulin an das neurale Zelladhäsionsmolekül NCAM im Nervensystem von Mus musculus (Linné 1758)

Abstract

In früheren Arbeiten wurde der Kalziumsensor Calmodulin als möglicher Bindungspartner für das neurale Zelladhäsionsmolekül NCAM entdeckt. Es konnte eine putative Calmodulinbindestelle innerhalb der intrazellulären Domänen von NCAM140 und NCAM180 identifiziert werden, welche die direkte Interaktion vermitteln soll. Im Rahmen dieser Arbeit konnte bestätigt werden, dass das inverse „14-8-5-1“ Motiv in der intrazellulären NCAM-Domäne die direkte Interaktion mit Calmodulin vermittelt. Die in dieses Motiv eingebrachten Punktmutationen inhibierten die Interaktion vollständig. Es konnte gezeigt werden, dass die Mutation der Calmodulinbindestelle das NCAM-abhängige Neuritenwachstum reduziert und sich ebenfalls auf die proteolytische Prozessierung von NCAM auswirkt. Experimente an Neuronen aus Primärkulturzellen des Hippocampus von NCAM-defizienten Mäusen weisen eine gestörte Morphologie auf, welche auf die mutierte Calmodulinbindestelle von NCAM140 zurückzuführen ist. Die Mutation hat dabei keinen Einfluss auf den Transport der NCAM-Isoformen 140 (Hippocampus-Neurone) und 140 und 180 (CHO-Zellen) an die Zelloberfläche und der Verteilung von NCAM entlang von Zellausläufern/Neuriten. Die eingefügten Punktmutationen innerhalb des Calmodulinbindungsmotivs überlappen mit den Palmitoylierungsstellen und der Tyrosin-Phosphorylierungsstelle des NCAMs. Die Lokalisation von NCAM140 in lipid rafts, die essentiell für NCAM-abhängiges Neuritenwachstum ist, wird durch die Mutation der Calmodulinbindestelle nicht beeinflusst. Die für die lipid rafts-Lokalisation entscheidenden Palmitoylierungsstellen werden durch die Punktmutationen nicht beeinträchtigt. Die Untersuchung der Palmitoylierung mittels Fluorographie und radioaktiv markierte Palmitinsäure unterstreicht dieses Ergebnis. Weiterhin ist die Tyrosin-Phosphorylierung von NCAM, welche durch BDNF angeregt wird, nicht inhibiert. Ein bekannter NCAM-Signaltransduktionsweg wird über die Nicht-Rezeptortyrosinkinasen Fyn und FAK vermittelt. Die Fyn-Phosphorylierung und somit Aktivierung des Fyn-abhängigen Signalwegs zeigt keine Effekte auf die Mutation der Bindestelle des Calmodulins. Die fokale Adhäsionskinase FAK hingegen, die Fyn in der Signalkette nachgeschaltet ist und ebenso mit NCAM interagiert, weist nach Stimulation durch NCAM-Antikörper die Entstehung eines zytosolischen, 55kDa-großen Fragments auf. Dieses Fragment ist nicht nachzuweisen, wenn die Calmodulinbindestelle mutiert ist. Die FAK-Phosphorylierung und damit -Aktivierung ist NCAM-stimulations- und Calmodulin-abhängig. Die Mutation der Calmodulinbindestelle reduziert die Phosphorylierung von FAK. Weiterführende Experimente konnten einen Zusammenhang zwischen der NCAM-Stimulation und der Entstehung und Lokalisation eines N-terminalen, 55kDa großen FAK-Fragments im Zellkern von CHO- und Cerebellum-Zellen zeigen. An mit NCAM-Antikörper stimulierten CHO-Zellen und Cerebellum-Neuronen konnte die Kernlokalisation von NCAM nachgewiesen werden. Es zeigte sich, dass NCAM140 eine Calmodulin- und NCAM-stimulationsabhängige Kernlokalisation aufweist, was durch Detektion eines 50kDa-Fragments bewiesen wurde. Die Entstehung dieses Fragments ist offenbar plasminabhängig, da der Plasmininhibitor Aprotinin einen negativen Einfluss auf diese Kernfragmente von NCAM hatte. Bei NCAM180 lassen sich zwei unabhängig voneinander entstehende Kernfragmente nachweisen. Ein ca. 100kDa-Fragment ist nur mit dem gegen die intrazelluläre NCAM-Domäne gerichteten Antikörper, welcher das NCAM180-spezifische Exon18 detektiert, zu lokalisieren. Die Entstehung dieses Fragments zeigte sich weder Calmodulin- noch NCAM-stimulationsabhängig. Allerdings führt ein TACE-spezifischer Inhibitor zur verminderten Bildung dieses Fragments. Interessanterweise entsteht ein weiteres NCAM180-Fragment, welches 50kDa-groß ist und ausschließlich nach NCAM-Stimulation im Zellkern nachweisbar ist. Die Detektion von löslichen NCAM-Fragmenten nach Stimulation zeigte sowohl für NCAM140 als auch für NCAM180 die Entstehung eines 50kDa-Fragments im Zellkulturüberstand von CHO-Zellen. Um die biochemischen Ergebnisse zu untermauern, konnte in immunzytochemischen Experimenten an Cerebellum-Neuronen gezeigt werden, dass nach NCAM-Stimulation sowohl NCAM als auch FAK im Zellkern vorzufinden sind. Dabei scheinen NCAM und FAK kernspezifisch zu co-lokalisieren, wie sich anhand der immunzytochemischen Ergebnisse zeigt. Die Funktion von NCAM im Kern sowie eine mögliche Beteiligung an der Regulation der Transkription von Genen, dies eventuell im Komplex mit FAK, ist noch unklar.

In the present study i show that calmodulin directly binds to the intracellular domain of NCAM140 and NCAM180 with high affinity in a Ca2+-dependent manner, while it does not bind to the intracellular domains of two other closely related cell adhesion molecules of the immunoglobulin superfamily, L1 and CHL1. In previous studies, so-called 1-5-10, 1-8-14 or 1-5-8-14 motifs have been identified as Ca2+-dependent calmodulin binding motifs. Disruption of this motif by mutation completely abolished binding of calmodulin to the intracellular domain of NCAM. In the presence of the calmodulin inhibitor CGS9343B, which specifically binds to calmodulin and inhibits the interaction with its binding partners, NCAM-dependent neurite outgrowth of cerebellar and hippocampal neurons was reduced. Furthermore disturbance of the direct interaction of calmodulin with NCAM by mutating the calmodulin binding site on NCAM led to an inhibition of NCAMdependent neurite outgrowth of hippocampal neurons. Recruitment of NCAM to lipid rafts is required for NCAM-stimulated neurite outgrowth and depends on palmitoylation of NCAM and triggers NCAM-mediated, FGF receptor-independent signaling via the fyn/fak pathway . Mutation of the calmodulin binding motif which overlaps with the palmitoylation sites has no significant effect on cell surface expression, palmitoylation and raft localization of this mutated NCAM. Furthermore, activation of fyn is also not impaired when the calmodulin binding site on NCAM is mutated. However, activation of fak was abolished by mutated NCAM upon NCAM stimulation, indicating that the binding of calmodulin to NCAM is required for the activation of fak. NCAM stimulation of neurons expressing mutated NCAM results in morphological alterations as seen by increased spine-like extensions from neurites and cell bodies and enhanced branching of neurites. This alteration is caused by the disruption of the binding of calmodulin to NCAM, which is required for directed neurite outgrowth. NCAM-induced neurite outgrowth depends on regulated association and dissociation of NCAM with the actin cytoskeleton via spectrin which binds to NCAM. NCAM interacts with fak and NCAM stimulation leads to fak activation which is required for NCAM-mediated neurite outgrowth . Here i showed that disruption of the binding of calmodulin to NCAM by mutation abrogated fak activation, but not fyn activation upon NCAM stimulation. In parallel to this phosphorylation, proteolytic processing of fak takes place upon NCAM stimulation. The cleavage of fak leads to the generation of a C-terminal fragment containing the focal adhesion targeting (FAT) domain which mediates the localization of fak to focal adhesion sites and a non-catalytic N-terminal fragment containing a domain that shares homology with the FERM (band four.1, ezrin, radixin and moesin) domain which regulates fak activity and signaling NCAM stimulation leads to the generation of NCAM fragments. A soluble 55 kDa fragment was recognized in the cell culture supernatant by an antibody against the extracellular domain of NCAM, while a fragment of 50 kDa was detected in detergent solubilized cell lysates and in nuclei by an antibody directed against the intracellular membrane-proximal sequence of NCAM and, interestingly, by an antibody against the extracellular domain of NCAM. When the calmodulin binding motif was mutated, the 50 kDa fragment was not generated, indicating that the binding of calmodulin is required for this cleavage of NCAM triggered by NCAM stimulation. However, the serine protease inhibitor aprotinin inhibits the generation of this fragment. Since aprotinin efficiently inhibits the protease plasmin and since it has been shown that NCAM is cleaved by plasmin resulting in the generation of a 60 kDa fragment, it is likely that plasmin cleaves the extracellular domain of NCAM and thus, is the responsible protease for the generation of the 50 kDa NCAM fragment observed in this study. A very interesting finding of this study is that the proteolytic processing of NCAM and fak is accompanied by an import of a C-terminal fragment of NCAM and a N-terminal fak fragment into the nucleus. The generation of both fragments depends on homophilic NCAM interaction and on the calmodulin binding site on NCAM, indicating that the interaction between calmodulin and NCAM is required for the proteolytic processing. Nuclear import of a fak fragment has been reported to occur upon stimulation of distinct signal transduction pathways. However, the functional roles of fak and NCAM fragments in the nucleus of neural cells are not known. Nuclear translocation of NCAM and fak fragments may represent an alternative or parallel signal pathway which functions in concert with or distinct from the known NCAM-induced pathways to induce cellular responses and/or to make NCAM´s signal transduction more unique in ontogenetic development, regeneration and synaptic plasticity.