Identifikation des Leberphasen-spezifisch exprimierten Proteins PbLSA4 von Plasmodium berghei (Vincke & Lips, 1948) und Charakterisierung des pblsa4-Promotorbereichs

Abstract

Über die Biologie des Leberstadiums von Plasmodien ist bisher wenig bekannt. Um mehr über diese Lebensphase des Parasiten zu erfahren, ist es vor allem wichtig Proteine zu identifizieren und zu charakterisieren, die nur von Leberstadien-Parasiten exprimiert werden. In diesem Zusammenhang ist auch die Regulation der Expression solcher Proteine interessant. In der vorliegenden Arbeit ist es durch RT-PCR-Analysen gelungen, ein Gen von P. berghei zu identifizieren, das nur während der Leberphase exprimiert wird und deshalb pblsa4 (liver stage antigen 4) genannt wurde. Aus Untersuchungen zum Zeitverlauf der pblsa4-Expression geht hervor, dass diese erst ca. 25h nach Infektion der Leberzelle einsetzt. Zur Kontrolle der Promotoraktivität wurde der vor dem pblsa4-Gen liegende 5´Bereich in ein für Plasmodien geeignetes Transfektions-plasmid vor das gfp-Gen kloniert. Damit konnte die Leberphasen-spezifische Aktivität des Promotorbereichs bestätigt und GFP nach 25h durch in vivo-Mikroskopie nachgewiesen werden. Um das Leberphasen-spezifische Protein PbLSA4 durch polyklonale Antikörper lokalisieren zu können, wurde das dazugehörige Gen in bakterielle Expressions-plasmide kloniert, PbLSA4 rekombinant exprimiert, gereinigt und zur Immunisierung von Mäusen verwendet. Mit dem aPbLSA4-Antiserum konnte gezeigt werden, dass sich das Protein im Bereich der parasitophoren Vakuole bzw. der Parasiten-Plasmamembran befindet. Darüber hinaus wurde das pblsa4-Gen in ein Transfektionsplasmid kloniert, um ein PbLSA4-GFP-Fusionsprotein zu erhalten. Der GFP-Nachweis durch Immunfluoreszenz-Analysen bestätigte dabei die durch das Antiserum gefundene Lokalisation des PbLSA4-Proteins. Um mehr über die Funktion von PbLSA4 zu erfahren, wurde ein Teil des Gens deletiert. Die Parasiten zeigten jedoch keine Beeinträchtigung in ihrer Entwicklung. PbLSA4 ist also entweder für den Parasiten nicht essentiell, oder seine Funktion wurde durch die Teildeletion nicht ausreichend gestört bzw. das PbLSA4-Defizit durch andere Proteine kompensiert. Darüber hinaus wurde das bakterielle Toxin Listeriolysin O (LLO) unter der Kontrolle des PbLSA4-Promotors in P. berghei exprimiert, um die Parasiten-Plasmamembran oder die parasitäre Vakuolenmembran zu schädigen und attenuierte Parasiten zu erzeugen. Dazu wurden verschiedene Ansätze verfolgt. Eine zunächst zytosolische LLO-Expression sollte zur Perforation der Parasiten-Plasmamembran führen. Da dies keine Beeinträchtigung des Parasiten zur Folge hatte, wurde durch die Expression eines PbLSA4-LLO-Fusionsproteins versucht, das Toxin in den Bereich der Parasiten-Plasmamembran zu leiten. Hier war zwar ein Effekt erkennbar, doch wurde der Parasit nicht ausreichend geschädigt. Um daraufhin das aktive LLO direkt zur Cholesterol-haltigen parasitophoren Vakuolenmembran zu dirigieren, wurde es mit dem Signalpeptid eines bekannten Parasitenproteins fusioniert. Obwohl die zuvor erfolgte Fusion dieses Signalpeptids mit GFP tatsächlich zu einem Transport des GFPs in die parasitophore Vakuole führte, war derselbe Ansatz mit LLO nicht erfolgreich. Durch die Versuche wurde gezeigt, dass LLO zwar exprimiert werden konnte, aber entweder nicht aktiv war oder nicht zu den Zielmembranen transportiert wurde. Daher müsste nach toxischen Proteinen gesucht werden, die tatsächlich zur Abtötung des Parasiten führen. Solche attenuierten Parasitenstämme könnten dann als effiziente Lebendvakzine eingesetzt werden. Im Falle der LLO-Expression in P. berghei war zwar keine ausreichend starke Attenuierung des Parasiten zu beobachten, jedoch können mit Hilfe des pblsa4-Promotorbereichs zukünftig weitere Toxine exprimiert werden, um den Parasiten zu attenuieren. Wenn diese Impfstrategie bei Mäusen erfolgreich getestet wurde, wäre ein ähnlicher Ansatz auch für humanpathogene Plasmodien denkbar.

Plasmodium berghei is the causative agent of rodent malaria and is widely used as a model system to study the liver stage of Plasmodium parasites. Only little is known about parasite-host interaction during the parasites liver-stage, so it is very important to examine proteins which are unique in this stage. In this work a strictly liver-stage specific protein called PbLSA4 (liver-stage-antigen 4) was identified via RT-PCR analysis. Additional RT-PCR analysis at different time-points during the liver-stage showed that the expression of PbLSA4 starts at about 24h post infection. Specific antibodies localized the protein at the plasma-membrane of the parasite. This localization was confirmed by creating transgenic parasites which expressed a PbLSA4-GFP fusion protein. By insertion of a plasmid into the pblsa4-gene locus an incomplete PbLSA4-protein were expressed by transgenic parasites, but in immune-fluorescence-analysis no impairment of growth or development was observed. After examination of the pblsa4-promoter-activity, this promoter was used to express a toxic protein to eliminate the parasite at the late liver-stage of infection. Listeriolysine O, a bacterial pore-forming protein was expressed by plasmodium-parasites under the control of the pblsa4-promoter. Listeriolysine O was not able to harm the parasite, but this technique could be a new strategy to create live-attenuated parasites by expressing a suicide-protein unique in the liver-stage of infection.