Molekulargenetische Charakterisierung von Patienten mit dem MLS-Syndrom : Identifizierung des ursächlichen Krankheitsgens

Abstract

Das MIDAS-(Mikrophthalmie, dermale Aplasie, Sklerocornea) oder MLS-(microphthalmia with linear skin defects) Syndrom ist durch uni-/bilaterale Mikrophthalmie, Sklerocornea und lineare Hautdefekte gekennzeichnet. Diese seltene X-chromosomale dominante Erkrankung ist für männliche Feten in utero letal und phänotypisch variabel. Obwohl einige Patientinnen karyotypisch unauffällig sind, zeigt die Mehrzahl der Patientinnen ein chromosomales Rearrangement, das meist mit einer terminalen Deletion des p-Arms eines der beiden X-Chromosomen einhergeht. In der für MLS kritischen Region (Xp22.2) sind die drei Gene MID1, HCCS und ARHGAP6 bekannt. Vor Beginn dieser Arbeit konnten in keinem der Gene Punktmutationen oder kleinere Rearrangements bei Patienten mit MLS identifiziert werden. Bei zwei Schwestern mit MLS und ihrer gesunden Mutter wurde eine Mikrodeletion identifiziert, die Teile von HCCS umfasst. Ausgehend von diesem Befund wurde eine HCCS-Mutationsanalyse bei zwei MLS-Patientinnen mit unauffälligem Karyotyp durchgeführt, die jeweils eine heterozygot vorliegende de novo Punktmutation, c.589C>T/p.R197X bzw. c.649C>T/p.R217C, ergab. Beide Mutationen wurden bei weiblichen Kontrollpersonen nicht nachgewiesen. HCCS kodiert für die mitochondriale Holocytochrom c-Typ-Synthase, die die kovalente Bindung zwischen der prosthetischen Hämgruppe und Apocytochrom c katalysiert, wodurch das reife Holocytochrom c entsteht. Dieses ist sowohl für die Atmungskette als auch für die Apoptose bedeutsam. Mithilfe eines Hefekomplementations-Assays wurde der Einfluss der Mutationen auf die HCCS-Funktion untersucht. Dazu wurde ein S. cereviseae-Stamm verwendet, dessen Atmungskettenfunktion aufgrund einer Deletion im HCCS-Ortholog (CYC3) gestört ist. Im Gegensatz zum HCCS-Wildtyp-Protein konnte keines der mutierten HCCS-Proteine den Enzymdefekt aufheben. Um zu prüfen, ob der Funktionsverlust der Proteine auf eine veränderte subzelluläre Lokalisation zurückzuführen ist, wurden mit einem HA-Epitop versehene HCCS-Fusionsproteine in CHO-K1-Zellen exprimiert und ihre intrazelluläre Verteilung analysiert. Während das HCCS-Wildtyp-Protein und das Protein mit der p.R217C-Mutation eine Lokalisation in den Mitochondrien zeigten, wies das aus der p.R197X-Mutation resultierende, C-terminal trunkierte HCCS-delta197-268-Protein eine zytoplasmatische und nukleäre Verteilung auf. Das Endprodukt der enzymatischen Reaktion der Holocytochrom c-Typ-Synthase, Holocytochrom c, ist an der oxidativen Phosphorylierung und der Apoptose beteiligt. Darüber hinaus konnte für das HCCS-Protein selbst eine pro-apoptotische Wirkung gezeigt werden. Zellen mit einer funktionellen Nullisomie für HCCS könnten daher neben einem schweren Atmungskettendefekt auch Störungen apoptotischer Prozesse aufweisen, sodass alternative Wege des Zelltods (z.B. Nekrose) begünstigt würden. Somit könnte in HCCS-defizienten Zellen das Gleichgewicht von Apoptose zu Nekrose verschoben sein, wodurch eine Schädigung der betroffenen Gewebe durch inflammatorische Prozesse resultieren könnte. Somit ist denkbar, dass der komplexe Phänotyp der Patientinnen mit MLS nicht nur auf einer Beeinträchtigung der Atmungskettenfunktion der HCCS-defizienten Zellen, sondern auch auf veränderten embryonalen Zelltodmechanismen beruht. Die phänotypische Variabilität bei Patientinnen mit MLS ist ausgeprägt. Wir haben eine Patientin mit klassischem MLS sowie ihre gesunde Mutter näher untersucht. Die Analyse ergab, dass die Tochter in allen 100 untersuchten Metaphasen der kultivierten Lymphozyten auf einem der beiden X-Chromosomen eine terminale Deletion trägt [46,X,del(X)(p22.2)], die das HCCS-Gen einschließt. Die gleiche Deletion wurde bei der Mutter in 89 von 100 Metaphasen nachgewiesen, während in 11 Metaphasen der Karyotyp 45,X festgestellt wurde. Eine Haplotyp-Analyse ergab, dass sich die Deletion auf dem paternalen X-Chromosom der Mutter ereignet hat. Beide Frauen wiesen ein komplett verschobenes X-Inaktivierungsmuster in den Blutzellen auf, wobei das X-Chromosom mit der Deletion stets inaktiviert vorlag. Die große phänotypische Variabilität bei MLS gab uns Anlass zu der Vermutung, dass Mutationen im HCCS-Gen bei Patienten mit isolierten Augenfehlbildungen vorkommen könnten. Deshalb wurde bei 27 weiblichen Neugeborenen mit einer isolierten bzw. syndromalen Form der Mikrophthalmie eine Mutationsanalyse im HCCS-Gen durchgeführt und bei einer Patientin mit bilateraler Mikrophthalmie und Sklerocornea die heterozygot vorliegende Missense-Mutation c.475G>A/p.E159K identifiziert. Funktionelle Analysen ergaben eine mitochondriale Lokalisation des HCCS-E159K-Proteins, jedoch konnte es die gestörte Atmungskettenfunktion des CYC3-defizienten Hefestamms nicht komplementieren. Die Identifizierung einer wahrscheinlich pathogenen Mutation bei einem Mädchen mit isolierten okulären Fehlbildungen deutet darauf hin, dass es sich bei HCCS um ein Kandidatengen für schwere isolierte Entwicklungsstörungen der Augen handelt.