Polyamine in Plasmodium falciparum (Welch, 1897) : Einfluss von Inhibitoren der Syntheseenzyme auf Polyamingehalt und Wachstum

Abstract

Malaria ist mit jährlich über einer Millionen Toten die bedeutendste parasitäre Tropenkrankheit. Die sich in zunehmendem Maße ausbreitenden Resistenzen gegen die herkömmlichen Malariamedikamente erschweren das Bemühen, diese Krankheit zu kontrollieren; infolgedessen ist es von dringender Notwendigkeit, neue potentielle Ziele im Stoffwechsel von P. falciparum für die Entwicklung von Chemotherapeutika zu identifizieren. Hinsichtlich der pathophysiologischen Auswirkungen der Malaria tropica sind die erythrozytären Stadien von entscheidender Bedeutung. Die Infektion mit P. falciparum ändert die metabolischen Bedürfnisse des Parasit-Wirtszellen-Systems, da in kürzester Zeit genügend RNA, DNA und Protein synthetisiert werden muss, um die Entwicklung neuer Merozoiten zu gewährleisten. Die hohe Proliferationsrate geht mit einem gesteigerten Bedarf an den Polyaminen Putrescin, Spermidin und Spermin einher, die eine elementare Rolle bei Proliferation und Differenzierung der Zellen spielen. Entsprechend konnten in P. falciparum-infizierten Erythrozyten im Laufe der Parasitenentwicklung deutlich steigende Mengen an Polyaminen gefunden werden. Nach Trennung von Parasit und Wirtszelle durch Verwendung des porenbildenden Toxins Streptolysin O konnte gezeigt werden, dass der Großteil der Polyamine mit dem Parasiten assoziiert ist. Aufgrund des Zusammenhangs zwischen Vermehrungsprozess und Polyaminbedarf bietet eine Blockierung des Polyaminbiosyntheseweges eine Möglichkeit der Bekämpfung parasitärer Infektionen. Dieser Ansatz birgt viel versprechende Perspektiven, da sich die Stoffwechsel von Wirt und Parasit unterscheiden; in P. falciparum sind die Schlüsselenzyme der Polyaminsynthese, die S-Adenosylmethionin-Decarboxylase (AdoMetDC) und die Ornithin-Decarboxylase (ODC) auf einem bifunktionellen PfAdoMetDC/ODC-Polypeptid angeordnet, während sie bei Säugern durch zwei Genorte repräsentiert und unabhängig transkribiert und translatiert werden. AdoMet, dessen decarboxylierte Form für die Synthese von Spermidin und Spermin benötigt wird, wird durch die S-Adenosylmethionin-Synthetase (AdoMet-Synthetase) aus Methionin und ATP gebildet. Die PfAdoMet-Synthetase wurde rekombinant exprimiert und charakterisiert. Biochemische Parameter wie molekulare Masse, pH-Optimum, Km-Wert, spezifische Aktivität und K+-Abhängigkeit gleichen weitgehend denen anderer bisher charakterisierten AdoMet-Synthetasen. Mutationsstudien zeigten, dass die Aminosäurereste Asp24, Asp127, Asp238, Asp271, Glu50 der PfAdoMet-Synthetase für die Bindung von Methionin, Mg2+, K+ und für die katalytische Aktivität essentiell sind. Alle Mutanten zeigten nur noch etwa 1-3% Restaktivität. Für ODC, AdoMetDC und AdoMet-Synthetase wurden verschiedene Inhibitoren hinsichtlich ihres Einflusses auf Enzymaktivität, Wachstumsrate und Polyaminkonzentration untersucht. Die AdoMet-Synthetase-Inhibitoren Selenomethionin und Cycloleucin inhibierten das Wachstum von P. falciparum mit IC50-Werten von 65 Mikro-Mol bzw. 7,5 mM. Selenomethionin inhibiert darüber hinaus die PfAdoMet-Synthetase mit einem Ki-Wert von 89 Mikro-Mol. Der Einfluss des Selenomethionins auf die AdoMet- und Polyamin-Konzentrationen wurde ebenfalls quantifiziert. Hier zeigte sich eine AdoMet-Abnahme auf etwa 50% der Kontrollen, ein Einfluss auf die Polyaminmengen war jedoch nicht festzustellen. Die AdoMetDC-Inhibitoren CGP 40215A und MDL 73811 zeigten für die PfAdoMetDC Ki-Werte bei etwa 1,5 Mikro-Mol und blockierten das Zellwachstum mit IC50-Werten zwischen 2-3 Mikro-Mol. Während MDL 73811 jedoch zu stark erhöhten Putrescin- und verringerten Spermidin- und Sperminkonzentrationen führte, war ein entsprechender Effekt für CGP 40215A nicht festzustellen. Dies weist darauf hin, dass der Inhibitionsmechanismus von CGP 40215A auf einen anderen Zielort gerichtet ist. Der ODC-Inhibitor APA und dessen Derivate CGP 54169A und CGP 52622A zeigten bereits in sehr niedrigen Konzentrationen gravierende Effekte; die PfODC wurde mit Ki-Werten zwischen 3-17 nM inhibiert, das Wachstum der Plasmodienzellen stagnierte mit IC50-Werten zwischen 1-3 Mikro-Mol. Darüber hinaus war ein Zusammenhang zwischen hemmendem Effekt und Auswirkungen auf die Polyaminkonzentrationen zu erkennen; die Inkubation mit 1-5 Mikro-Mol der Inhibitoren resultierte in einer fast vollständigen Abnahme des Putrescins, Reduzierung des Spermidins und Anstieg des Spermins. Die Zugabe exogenen Putrescins hob die Wachstumsblockierung auf, was die Spezifität dieser Inhibitoren unterstreicht. Mit diesen Werten zeigt diese neuere Generation von ODC-Inhibitoren um ein vielfaches bessere Effekte als der bekannteste ODC-Inhibitor DFMO, der bereits erfolgreich in der Krebstherapie und bei der Behandlung der Schlafkrankheit eingesetzt worden ist. Deshalb sollten besonders die Leitstruktur APA und dessen CGP-Derivate dringend weiter untersucht werden, um ihre Eigenschaften im Tiermodell zu testen und zu evaluieren, ob sie sich als potentielle Kandidaten für die Entwicklung als Antimalaria-Chemotherapeutikum eignen.

The malaria parasite Plasmodium falciparum is responsible for the death of more than one million people annually. One of the most important problems in the fight against malaria is the increasing spread of resistance against the available antimalarial drugs. Hence there is an urgent need to identify new potential targets in the metabolic pathways of P. falciparum for the development of effective chemotherapeutics. Infection of human erythrocytes with P. falciparum causes changes in the metabolic needs of the parasite-host-system, due to the fact that within a short time a sufficient amount of RNA, DNA and protein must be synthesised to guarantee the development of new merozoites. The high proliferation rate is accompanied by an increased need of the polyamines putrescine, spermidine and spermine. They play an important role in the proliferation and the differentiation of the cells. Correlatively, a significant increase of polyamine amounts could be detected in P. falciparum-infected erythrocytes during the development of the parasite. The distribution of the polyamines in the parasite-host unit was analysed by separating the parasites from the host RBCs using the pore-forming toxin Streptolysin O; the majority of the polyamines was found to be associated with the parasite. Due to the relation between the proliferation process and the polyamine demand a blockage of the polyamine biosynthesis offers a promising opportunity to combat parasitic infections. This basic approach is of particular interest because the metabolism of host and parasite shows major differences. In P. falciparum the two key enzymes S-adenosylmethionine decarboxylase (AdoMetDC) and ornithine decarboxylase (ODC) are located on a single bifunctional polypeptide (PfAdoMetDC/ODC), while in mammals they are represented by two gene loci and are transcribed and translated independently. AdoMet is synthesised by the reaction of methionine and ATP, catalysed by the S-adenosylmethionine synthetase (AdoMet synthetase). Its decarboxylated form is required for the synthesis of spermidine and spermine. The PfAdoMet synthetase was recombinantly expressed and characterised. Biochemical parameters like the molecular mass of the subunits, pH-optimum, Km-values, specific activity and K+-dependency resemble mostly those of other AdoMet synthetases analysed so far. By means of mutational studies it was shown that the amino acid residues Asp24, Asp127, Asp238, Asp271, Glu50 of the PfAdoMet synthetase are responsible for the binding of methionine, Mg2+ and K+ and are essential for the catalytic activity. In all cases the activity of the mutants drastically decreased and showed only 1-3% of the wild type activity. Additionally, different inhibitors for the ODC, AdoMetDC and AdoMet synthetase were analysed with regard to their influence on enzyme activity, growth rate and polyamine as well as AdoMet amounts. Selenomethionine and cycloleucine, inhibitors of the AdoMet synthetase, inhibited the growth of P. falciparum with IC50-values of 65 Micro-Mol and 7,5 mM. Furthermore, selenomethionine inhibited the PfAdoMet synthetase with a Ki-value of 89 Micro-Mol. This inhibitor caused a decrease of 50% of AdoMet, but there was no change in the polyamine amounts detectable. The AdoMetDC inhibitors CGP 40215A and MDL 73811 showed Ki-values of approximately 1,5 Micro-Mol for the PfAdoMetDC and inhibited the cell growth with IC50-values between 2-3 Micro-Mol. While treatment with MDL 73811 resulted in strongly elevated putrescine amounts and reduced spermidine and spermine concentrations, no corresponding effect for CGP 40215A could be observed. This suggests a mechanism of action for CGP 40215A that does not depend on polyamine depletion. The ODC inhibitor APA and its derivatives CGP 54169A and CGP 52622A exhibited an effective inhibition in very low concentrations. The PfODC was inhibited by these compounds with Ki-values between 3-17 nM, growth of the cultured Plasmodium cells also stagnated with IC50-values between 1-3 Micro-Mol. Moreover, a connection between the inhibitory effect and the impact on the polyamine concentration exists. Incubation of the Plasmodium culture with 1-5 Micro-Mol of the inhibitors resulted in almost complete depletion of putrescine, decrease of spermidine concentrations and enhanced spermine levels. Supplementation with exogenous putrescine restored the growth of ODC inhibitor-treated P. falciparum, substantiating the specificity of these inhibitors. These results show clearly that the effects of this new generation of ODC inhibitors are many times better compared to those of the classical ODC inhibitor DFMO, which has been used successfully in cancer therapy and against the protozoan parasite Trypanosoma gambiense. Therefore especially the lead compound APA and its CGP derivatives should be further investigated to substantiate their properties in an animal model and to evaluate whether they are suited as potential candidates for the development as an antimalarial chemotherapeutic.