Lokalisierung und funktionelle Bedeutung der NO-sensitiven Guanylatzyklase und cGMP-regulierter Phosphodiesterasen : Untersuchungen am kardiorespiratorischen System und am männlichen Reproduktionstrakt

Abstract

Der intrazelluläre Botenstoff zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) kommt als wichtiger „second messenger“ im Körper weit verbreitet vor. Über Expression, genaue Lokalisation und Funktion der an cGMP-abhängiger Signaltransduktion beteiligten Enzyme bestehen noch unzureichende Kenntnisse, obwohl bereits seit längerem pharmakotherapeutisch sowohl cGMP-Bildung durch exogene Nitrate als auch cGMP-Abbau durch Phosphodiesterase (PDE)-Hemmstoffe beeinflusst werden. Orientiert an der pharmakologischen Anwendung von Nitraten im Bereich kardiopulmonaler Erkrankungen und von PDE-Inhibitoren zur Behandlung der erektilen Dysfunktion wurde die NO-sensitive lösliche Guanylatzyklase (sGC) in Herz und Lunge sowie die PDE2, 5 und 6 im männlichen Reproduktionstrakt untersucht. In Herz und Lunge konnte eine altersabhängig variable Expression der sGC im Western blot mit Hilfe eines neu entwickelten Antikörpers gegen die ß1-Untereinheit nachgewiesen werden. Das postnatal beobachtete Expressionsmaximum korrelierte mit Messungen der sGC-Aktivität in Herz und Lunge verschiedener Altersstufen. Immunhistochemische Untersuchungen der Organschnitte zeigten eine Lokalisation der sGC vor allem in den Gefäßen. Altersabhängig war eine Veränderung des Expressionsmusters von einer postnatal überwiegenden Muskellokalisation zu einer im Erwachsenenalter dominierenden Expression im Gefäßendothel zu beobachten. Im männlichen Reproduktionstrakt wurden die cGMP-bindenden PDEs 2, 5 und 6 untersucht. Die Verbindung von Western blot-Analysen und Immunhistochemie zeigte neben speziesspezifischen Unterschieden in der Expression der cGMP-stimulierten PDE2A auch eine subzellulär variable Lokalisation des Enzyms. Eine perinukleäre Färbung, die für eine Golgi-Assoziation spricht, wurde in venösen und kapillären Endothelzellen von Hoden und Nebenhoden, im Epithel des Ductus epididymidis und in Keimzellen beobachtet. Die in Leydigzellen beobachtete homogene Färbung spricht für eine zytoplasmatische Lokalisation. Die cGMP-abbauende PDE5 fand sich im Hoden in kontraktilen peritubulären Myofibroblasten und in Leydigzellen, außerdem ließ sie sich in der Muskelschicht von Hoden- und Nebenhodengefäßen lokalisieren. Die als ein Enzym der Phototransduktion bekannte cGMP-spezifische PDE6 wurde altersabhängig in testikulären Keimzellen und in Spermatozoen exprimiert. Exemplarische in vitro-Untersuchungen der PDE-Funktion mit selektiven Inhibitoren wiesen Veränderungen der im ELISA gemessenen Spiegel zyklischer Nukleotide nach, die erste Hinweise auf die Funktionalität der untersuchten PDEs in Organen des männlichen Reproduktionstrakts geben. Die vorliegende Arbeit illustriert mit der Darstellung einer altersabhängig variablen Expression und Lokalisation der beteiligten Komponenten wie auch einer möglichen subzellulären Kompartimentierung des Signalwegs einen Teil der zahlreichen Facetten, die die Wandlungsfähigkeit des cGMP-Systems ausmachen, und trägt damit zum detaillierteren Verständnis der cGMP-vermittelten Signaltransduktion und zur Erschließung neuer Möglichkeiten einer pharmakologischen Einflußnahme bei.

Intracellular cyclic nucleotide guanosine monophosphate (cGMP) is an important second messenger molecule widely distributed within the body. Precise kowledge on expression, exact localisation and function of enzymes related to cGMP-dependent signal transduction is still lacking despite the therapuetic use of exogenous nitrates and phosphodiesterase (PDE)-inhibitors to influence cGMP-generation and its degradation, respectively. Parallel to the pharmacological use of nitrates in the area of cardiopulmonary diseases and PDE-inhibitors to treat male erectile dysfunction, NO-sensitive soluble guanylate cyclase (sGC) was investigated in heart and lung whereas PDE 2,5 and 6 was studied in male reproductive organs. In hearts and lungs, an age-dependent variable expression of sGC was shown in Western blot analysis using a recently developed antibody against the beta1-subunit. A postnatal expression maximum correlated with measurements of sGC-activity in hearts and lungs of different ages. Immunohistochemical examination of organ slices localised sGC mainly to vessels. Depending on age a changing pattern of expression was observed with a predominant expression in vascular smooth muscle at postnatal age whereas localisation was mainly observed in vascular endothelial cells observed at adult age. PDE 2, 5 and 6 were investigated in male reproductive organs. By Western blot and immunohistochemistry species-specific differences in the expression of cGMP-stimulated PDE2A were shown as well as a varying subcellular localisation of the enzyme. A perinuclear staining suggesting an association with Golgi apparatus was observed in venous and capillary endothelial cells in testis and epididymidis, in epithelia of Ductus epididymidis and in germ cells. A homogenous staining observed in Leydig cells suggests a cytoplasmatic localisation. cGMP-degrading PDE5 was found in testis in contractile peritubular myofibroblasts and in Leydig cells as well as in smooth muscle cells of testicular and epididymidal vessels. PDE6, a cGMP-specific enzyme involved in phototransduction, was expressed in germ cells and spermatozoa. In vitro-investigations of PDE-function using selective inhibitors showed differences in the levels of cyclic nucleotides as measured by ELISA and suggest a functional role for the investigated PDEs in male reproductive organs. Describing an age-dependently varying pattern of expression and localisation of cGMP-related components as well as a possible subcellular compartmentation of the signal transduction pathway, this thesis illustrates a part of many possibilities to modify the cGMP-system and thus contributes to a more detailed knowledge of cGMP-dependent signal transduction and may help to develop new possibilities of pharmocological intervention.