Funktionen der Ubiquitinligasen RLIM und Rnf6 in der Regulation von LIM-Domänen Proteinnetzwerken

Abstract

Ziel dieser Arbeit war die Identifikation eines zu RLIM homologen Proteins, sowie die Charakterisierung der molekularen Mechanismen der Wirkungsweise von RLIM und seines Homologs im LIM-Proteinnetzwerk.

LIM-Domänen Proteine wurden im Zellkern und Cytoplasma gefunden und besitzen Schlüsselfunktionen für die Entstehung komplexer Organismen. So sind nukleäre LIM-Homeodomänen Transkriptionsfaktoren (LIM-HD) unter anderem in die Spezifizierung von neuronalen Zelltypen bei der Entwicklung des Nervensystems involviert, während die cytoplasmatische LIM Kinase (LIMK) ein wichtiger Regulator des Aktin-Cytoskeletts ist. Die LIM-Domäne vermittelt Protein-Protein-Wechselwirkungen und da meist mehrere LIM-Domänen in einem Protein auftreten, ermöglichen LIM Proteine die Bildung von Multi-Proteinkomplexen. Im Zellkern wurden neben den LIM-HD und den LIM-only Onkoproteinen (LMO) auch die LIM-Domänen bindende Familie der CLIM/Ldb/NLI/Chip-Kofaktoren und RLIM gefunden. Die Interaktion der CLIM Kofaktoren ist für die biologische Aktivität, die durch die LIM-HD Transkriptionsfaktoren vermittelt wird, essentiell. RLIM hingegen hemmt die Aktivität der LIM-HD Proteine.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte RLIM als eine Protein Ubiquitinligase identifiziert werden, die sich selbst, CLIM Kofaktoren und LMO-Proteine ubiquitinieren kann. RLIM ist in der Lage das LIM-HD Proteinnetzwerk durch zwei unterschiedliche Mechanismen zu reprimieren: es rekrutiert den Histondeacetylase-Korepressorkomplex (HDAC) und kann den Abbau der CLIM Kofaktoren vermitteln. Da auch HDAC2 als Substratprotein für eine RLIM-vermittelte Ubiquitinierung und Abbau diente, konnte eine weitere Funktion von RLIM gefunden werden.

Es gelang mir das RINGfinger Protein Rnf6 aufgrund hoher Sequenzhomologien als RLIM-Homolog zu identifizieren. Mit Hilfe spezifischer Antiseren konnte gezeigt werden, dass RLIM hauptsächlich im Zellkern, Rnf6 jedoch im Cytoplasma lokalisiert ist. Ein nukleäres Kernsignal (NLS) und ein nukleäres Exportsignal (NES) wurden sowohl auf RLIM als auch auf Rnf6 identifiziert. Detaillierte Analysen ergaben, dass RLIM und Rnf6 zwischen dem Kern und dem Cytoplasma hin und her transportiert werden können. Als entscheidend für die Lokalisation von RLIM und Rnf6 konnten die Sequenzen des NLS bzw. NES in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenzumgebung charakterisiert werden. Für RLIM konnte außerdem zusätzlich die Fähigkeit zur RNA-Bindung nachgewiesen und diese auf die NLS-Region eingegrenzt werden.

Im Cytoplasma konnte die LIMK als Substratprotein von Rnf6 identifiziert werden. Ihr Abbau wird nur durch Rnf6 vermittelt. Diese Daten weisen auf eine Beteiligung von Rnf6 an der Regulation des Aktin-Cytoskeletts hin. Daher werden vermutlich die Funktionen von RLIM hauptsächlich im Zellkern und die von Rnf6 im Cytoplasma ausgeübt. Die Befunde, dass es durch RLIM und Rnf6 bei unterschiedlichen Substraten zum Abbau kommt, tragen entscheidend zum Verständnis der Regulation des LIM-Proteinnetzwerks durch die Proteinfamilie RLIM/Rnf6 bei.

Diese Ergebnisse zeigen zentrale Funktionen der Proteinfamilie RLIM/Rnf6 für die Regulation von nukleären und cytoplasmatischen LIM-Proteinnetzwerken auf. Damit werden solch wichtige zelluläre Prozesse wie die Regulation der Transkription und der Aktindynamik kontrolliert.

The goal of this research project was to elucidate the molecular mechanisms of the RING finger protein RLIM in the regulation of the LIM protein network and to compare this regulation with that of Rnf6, a protein with high sequence homology to RLIM.

LIM-domain proteins are found in the cell nucleus and cytoplasm and possess key functions during the development of complex organisms. Indeed, the nuclear LIM homeodomain transcription factors (LIM-HD) specify neuronal cell identity during central nervous system development, whereas the cytoplasmic LIM kinase (LIMK) plays a central role in the organization of the actin cytoskeleton. The LIM-domain is a protein-protein interaction motif, mediating interactions with a variety of proteins and thereby promoting the formation of multiorder protein complexes. In addition to the LIM-HD transcription factors and the LIM only oncoproteins (LMO), two classes of LIM domain-interacting cofactors can be found in the nucleus: CLIM/Ldb/NLI/Chip cofactors and RLIM. The interaction of the CLIM cofactor family with LIM domains is important for the biological activity conferred by LIM-HD transcription factors, while RLIM inhibits this activity.

In the course of this doctoral thesis I first investigated the molecular mechanism of RLIM’s inhibitory action on the LIM-HD system. It could be demonstrated that RLIM is a ubiquitin protein ligase, capable of mediating ubiquitination of CLIM cofactors leading to proteasomal degradation. Additional data measuring LIM-HD mediated gene activation in transient transfections indicated that RLIM can exert its repressive function on LIM-HD transcription by two mechanisms: either by recruiting histone deacetylase corepressor proteins (HDAC) or by the degradation of positive CLIM cofactors. A novel function of RLIM was elucidated showing that it is capable of targeting not only CLIM, but also the HDAC2 proteins, for proteasome-mediated degradation. Furthermore, the RING finger protein Rnf6 was identified as a close homologue to RLIM. Using specific antibodies I showed that RLIM was found primarily in the nucleus whereas Rnf6 was detected in the cytoplasm of cultured cells. Both functional nuclear localisation signals (NLS) and nuclear export signals (NES) were identified on both proteins which allow RLIM and Rnf6 to shuttle between the nucleus and cytoplasm. Additionally, I demonstrated that the NLS of RLIM, but not of Rnf6, is capable of binding RNA.

LIMK was identified during the search for cytoplasmic Rnf6 substrate proteins. Subsequently, it could be demonstrated that Rnf6 targets cellular LIMK for proteasomal degradation. These results indicate a role for Rnf6 in the regulation of cellular actin dynamics with important consequences for cell motility and development of neuronal projections, and tumor cell metastasis. It can be concluded that RLIM acts primarily in the nucleus while Rnf6 acts in the cytoplasm. The different subcellular localization of RLIM and Rnf6 results in their mediating the degradation of different proteins, thus shedding light on the individual roles of RLIM and Rnf6 in the LIM protein network.

Taken together, these results show that the RLIM/Rnf6 family of ubiquitin ligases occupy central positions in the regulation of nuclear and cytoplasmic LIM-associated protein networks. Thus, the RLIM/Rnf6 family is a central position to regulate crucial cellular functions in different cellular compartments such as transcription and actin dynamics.