Pharmacological manipulation of the purinergic P2X7 receptor : effects on tumor and host cells

Abstract

The purinergic P2X7 receptor is an ATP-gated cation channel expressed by various immune and tumor cells. Expression of P2X7 by tumor cells can favor tumor growth by raising mitochondrial calcium levels and stimulating the cell metabolism. On the other hand, strong stimulation of P2X7 can cause cell death. Expression of P2X7 by antigen presenting cells (APCs) results in maturation of dendritic cells and thus is detrimental to the tumor by enhancing the anti-tumor immune response. Little is known about the role of P2X7 in the context of chemotherapy. Therefore, I studied the effects of P2X7 stimulation in the presence of chemotherapeutic agents that induce immunogenic cell death (i.e., doxorubicin (DOX) and bortezomib (BTZ). For in-vitro cytotoxic studies I used Yac-1 lymphoma cells that express P2X7 endogenously and also other cell lines (A20 B lymphoma cell line, 4T1 mammary carcinoma cell line) that were transduced with P2X7 variants. Low doses (100 to 200 µM) of extracellular ATP (eATP) that were not toxic by their own synergistically enhanced the sensitivity to DOX and BTZ. Transient exposure to eATP and DOX for one hour was sufficient to induce cell death after overnight culture. Mechanistically, gating of P2X7 augmented the initial uptake of DOX into cells. However, a decrease in cell death was observed when an important pathway of unfolded protein response, PKR ER kinase (PERK) was blocked by using PERK inhibitor, suggesting that the synergism was rather due to an interaction of downstream signaling pathways. I observed that ATP mediated P2X7 activations resulted in the phosphorylation of eIF2 as well as calreticulin (CRT) translocation to the cell surface, which are important hallmarks of immunogenic cell death. For in-vivo studies, tumor graft models were prepared using Yac-1 lymphoma cells (injected i.v. in SCID mice) and 4T1 breast cancer cell line (stably transduced with functional or nonfunctional P2X7 by using retroviral vector) injected in mammary fat pad of Balb/C mice. In Yac-1 injected mice, tumor size was measured using optical image system while in the 4T1 injected mice, tumor volume was assessed by using caliper. In both animal models expression of P2X7 receptor by tumor cells slowed down the tumor growth. My results showed that P2X7 activation synergistically enhance the cytotoxic effects of chemotherapy in vitro. Expression of P2X7 by tumor cells helped in tumor cell killing, both in-vivo and in-vitro. Therefore, P2X7 receptor activation on tumor cells could be considered as a combination therapy for better therapeutic outcomes.

Der purinerge P2X7-Rezeptor ist ein ATP-gesteuerter Kationenkanal, der sowohl von hämatopoetischen als auch von vielen Tumorzellen exprimiert wird. Die Expression von P2X7 bietet einen Wachstumsvorteil für Tumorzellen, indem der mitochondriale Calciumgehalt erhöht und der Zellstoffwechsel stimuliert wird. Andererseits kann eine starke Stimulierung von P2X7 zum Tod von Tumorzellen führen, und die Expression von P2X7 durch Wirtsimmunzellen ist für den Tumor schädlich, indem sie die Antitumor-Immunantwort verstärkt. Über die Rolle von P2X7 in der Chemotherapie ist wenig bekannt. Ich untersuchte daher die Auswirkungen der P2X7-Stimulation in Gegenwart von Chemotherapeutika die einen immunogenen Zelltod auslösen, wie z.B. doxorubicin (DOX) und bortezomib (BTZ). Zur Untersuchung der In-vitro-Toxizität wurden Yac-1-Lymphomzellen, die P2X7 endogen exprimieren, sowie weitere mit P2X7-Varianten stabil transduzierte Zelllinien (A20 B-Lymphom, 4T1 Mammakarzinom) verwendet. Niedrige Dosen von extrazellulärem ATP (eATP), die selbst eine geringe Toxizität verursachten, erhöhten die Empfindlichkeit gegenüber DOX um das 7- bis 8-fache. Eine einstündige vorübergehende Exposition gegenüber eATP und DOX reichte aus, um den Zelltod nach einer Kultur über Nacht auszulösen. Mechanistisch erhöhte das Gating von P2X7 zwar die anfängliche Aufnahme von DOX in Zellen. Der verstärkte Zelltod konnte jedoch durch Blockade von PERK, einer zentralen Kinase des ER-Stress Signalweges abgeschwächt werden, was darauf hindeutete, dass der Synergismus eher auf einer Wechselwirkung nachgeschalteter Signalwege beruhte. Die Aktivierung von P2X7 durch ATP führte zur Phosphorylierung des PERK-Substrats eIF2 und zur Translokation von Calreticulin an die Zelloberfläche, zwei Kennzeichen des immunogenen Zelltodes. Als Tumormodelle für in vivo Untesuchungen wurden Yac-1 T-Lymphom Zellen nach i.v. Injektion in SCID Mäuse sowie 4T1 Mammakarzinom-Zellen (stabil retroviral transduziert mit funktionalem oder nicht-funktionalem P2X7) nach lokaler Injektion in das Brustfettgewebe von Balb/C Mäusen verwendet. Dabei wurde die Tumorgröße im Yac-1 Modell durch Bildgebung, im 4T1 Modell durch einen Messchieber gemessen. In beiden Modellen verlangsamte die Expression von funktionalem P2X7 durch Tumorzellen das Tumorwachstum Meine Ergebnisse zeigen, dass P2X7 auf Tumorzellen zum Erfolg der Chemotherapie beitragen kann, und legen nahe, dass die Modulation der P2X7 Aktivität eine mögliche therapeutische Strategie zur Erhöhung der Zytotoxizität von Chemotherapeutika darstellt.