Entwicklung und Anwendung einer Fed-batch-Betriebsweise mit Nährstofffreisetzungssystemen zur kontrollierten Kultivierung und zum Screening von Mikroorganismen in Schüttelreaktoren

Jeude, Markus; Büchs, Jochen

doi:HT015286690

Entwicklung und Anwendung einer Fed-batch-Betriebsweise mit Nährstofffreisetzungssystemen zur kontrollierten Kultivierung und zum Screening von Mikroorganismen in Schüttelreaktoren = Development and application of a fed-batch mode with nutrient release systems for controlled cultivation and screening of microorganisms in shaken bioreactors

Jeude, Markus (Author)

2007

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Markus Jeude

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2007

UmfangXVII, 262 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2007

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Büchs, Jochen (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2007-05-18

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-19909
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/62434/files/Jeude_Markus.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik (416510)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Fed-batch-Verfahren (Genormte SW) ; Schüttelkolben (Genormte SW) ; Hansenula polymorpha (Genormte SW) ; Escherichia coli (Genormte SW) ; Gluconobacter oxydans (Genormte SW) ; Diffusion (Genormte SW) ; Glucose (Genormte SW) ; Grün fluoreszierendes Protein (Genormte SW) ; Freisetzung (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; langsame Freisetzung (frei) ; kontrollierte Freisetzung (frei) ; Schüttelreaktoren (frei) ; Zufütterung (frei) ; Fed-batch (frei) ; slow release (frei) ; controlled release (frei) ; shaken bioreactors (frei) ; feeding (frei) ; fed-batch (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die meisten industriellen Produktionsprozesse werden im Fed-batch-Verfahren betrieben. Im Gegensatz dazu wird das Selektionsverfahren der mikrobiellen Produktionssysteme im Batch-Betrieb durchgeführt. Dabei herrschen völlig andere physiologische Bedingungen als jene, die für ein Produktionsverfahren relevant sind. Es kann daher zu einer falschen Stammauswahl kommen. Um dieses Problem zu lösen, wurden Silicondisks mit eingelagerten Glucosekristallen entwickelt. Ein Fed-batch-Verfahren mit Diffusion von Glucose aus Silicondisks wurde in Schüttelreaktoren realisiert. Diese „Slow-release Fed-batch-Technik“ wurde am Stoffwechsel von H. polymorpha, E. coli und G. oxydans in Schüttelkolben getestet. Die OTR und der RQ wurden mit einer RAMOS-Anlage online aufgezeichnet. Biomassebildung, Synthese von GFP oder eYFP-IL-6, pH-Drift und die metabolische Dynamik von Glucose, Ethanol, Essigsäure und weiteren organischen Säuren wurden offline gemessen. Mit der Slow-release Fed-batch-Technik konnte der Overflow-Metabolismus bei H. polymorpha und E. coli im Vergleich zum Batch-Betrieb reduziert werden, was zu einer Erhöhung der Biomasseausbeute um bis zu 85% bzw. 59% führte. Bisher wurden 23,4 g/L Biotrockenmasse von H. polymorpha und 13,7 g/L E. coli erreicht. Die spezifischen Biomasseausbeuten von 0,38-0,47 liegen in der gleichen Größenordnung wie diejenigen von Laborfermentern mit einer Substratfütterpumpe. Die GFP-Expression durch H. polymorpha RB11 pC10-GFP konnte bis zu 35-fach in Syn6-MES- und 420-fach in YNB-Mineralmedium gesteigert werden. Im Fed-batch-Betrieb wurden bisher maximal 421 mg/L GFP synthetisiert. Im Gegensatz dazu wurden nur bis 2,5 mg/L GFP im Batch-Betrieb erhalten. Die Expression des Fusionsproteins, bestehend aus „stark gelb fluoreszierendem Protein und Interleukin-6 (eYFP-IL-6)“, durch E. coli BL21 pLys pRSET eYFP-IL6 konnte 4-fach in optimiertem Wilms-MOPS-Mineralmedium gesteigert werden. Bei Kultivierungen von G. oxydans DSM 2003 wurde im Vergleich zum Batch-Verfahren eine Erhöhung der spezifischen Biomasseausbeute um den Faktor 2,6 in Silberbach-MES-Komplexmedium erreicht. Es wurden im Gegensatz zu 1,6 g/L im Batch-Betrieb 3,3 g/L Biotrockenmasse erhalten. Durch Glucosefütterung wurde eine Reduktion der Bildung von Gluconsäure und 2- und 5-Ketogluconsäure bewirkt. Ein Massen-Screening wurde mit 265 H. polymorpha RB11 pC10-FMD und 267 pC10-MOX Klonen in Syn6-MES-Mineralmedium durchgeführt. Pro Klon wurden je eine Batch-Fermentation mit Glucose, eine mit Glycerin und eine Slow-release Fed-batch-Fermentation mit Glucose inokuliert. Das Screening wurde einmal wiederholt. Bei den verschiedenen Betriebsweisen resultierten grundlegende Unterschiede bezüglich Stammauswahl und Quantität der spezifischen GFP-Ausbeute. Es ist unwahrscheinlich, dass die besten Stämme für einen Fed-batch-Prozess im Batch-Screening gefunden werden. Ebenso wurde eine Abhängigkeit des regulierenden Promotors bei der Genexpression von der Art der Kohlenstoffquelle und der Betriebsweise entdeckt. Ein Fed-batch-Screening erweist sich folglich als sicherste Methode, um den richtigen Stamm für einen Fed-batch-Prozess zu identifizieren.

Most industrial production processes are performed in fed-batch operational mode. In contrast, the screenings for microbial production strains are run in batch mode which results in completely different physiological conditions than relevant for production. This may lead to wrong strain selections. Silicone elastomer discs containing glucose crystals were developed to realize fed-batch fermentation based on diffusion in shaken bioreactors. No other device for feeding was required. This “slow-release fed-batch technique” was tested on the metabolism of H. polymorpha, E. coli and G. oxydans in shake flasks. The OTR and RQ were monitored online with a RAMOS device. Biomass formation, synthesis of proteins like GFP or eYFP-IL-6, pH drift and metabolic dynamics of glucose, ethanol, acetic acid and other organic acids were measured offline. By application of the slow-release fed-batch technique in comparison to regular batch mode, overflow-metabolism of H. polymorpha and E. coli could be reduced, which led to an increase in biomass yield of up to 85% and 59%, respectively. Up to date, 23.4 g/L cell dry weight of H. polymorpha and 13.7 g/L of E. coli was achieved. The specific biomass yields of 0.38-0.47 are in the magnitude of those in laboratory fermentors equipped with a substrate feed-pump. The GFP expression by H. polymorpha RB11 pC10-GFP could be improved in Syn6-MES and YNB mineral media up to 35-fold and 420-fold, respectively. The synthesized maximum in fed-batch mode was 421 mg/L GFP. In contrast only up to 2.5 mg/L GFP was received in batch mode. The expression of eYFP-IL-6 by E. coli BL21 pLys pRSET eYFP-IL6 could be increased 4-fold in optimized Wilms-MOPS mineral medium using the slow-release fed-batch technique. Slow-release fed-batch cultures of G. oxydans DSM 2003 revealed a 2.6-fold increase of specific biomass yield in modified Silberbach-MES complex medium. A cell dry weight of 3.3 g/L was obtained in contrast to 1.6 g/L in batch mode. Due to glucose feeding a reduction of gluconic acid as well as 2- and 5-ketogluconic acid formation was monitored. A mass screening of 265 H. polymorpha RB11 pC10-FMD clones and 267 pC10-MOX clones was performed in Syn6-MES mineral medium in deep-well plates. A batch with glucose and one with glycerol were performed simultaneously in comparison to a slow-release fed-batch with glucose. One repetition screening was done under the same conditions. These diverse operational modes revealed great differences in strain selection and quality of specific GFP yield. The best strains for a fed-batch would be unlikely found in either batch mode. A dependence on the carbon source and the operational mode was found in relevance to the regulating promoter for gene expression. A fed-batch screening points out to be the most secure way to select the right strain for a fed-batch production process.

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