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Kovalente und nicht-kovalente Interaktion ligandengesteuerter Ionenkanäle mit Ubiquitin in Xenopus-laevis-Oozyten
2006
Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2006
Genehmigende Fakultät
Fak10
Hauptberichter/Gutachter
Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2006-08-02
Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-16349
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/52529/files/Chakravertty_Anastasia.pdf
Einrichtungen
Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Medizin (frei) ; Ionenkanal (frei) ; Ubiquitin (frei) ; Ubiquitin-Protein-Ligase (frei) ; GABA-Rezeptor (frei) ; Glycin (frei) ; Glatter Krallenfrosch (frei) ; Glycin-Rezeptor (frei) ; Parkin (frei) ; Synphilin (frei) ; SDS-PAGE (frei) ; BN-PAGE (frei)
Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610
Kurzfassung
Die Aminosäure Glyzin ist neben der gamma-Aminobuttersäure (GABA) einer der wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter des Zentralnervensystems. Der Glyzin-Rezeptor (GlyR) gehört wie der GABAA-Rezeptor (GABAAR) und der nikotinische Acetylcholin-Rezeptor (nAChR) zur Superfamilie der nikotinischen ligandengesteuerten Ionenkanäle, die auch unter dem Begriff der „Cys-loop“-Rezeptoren zusammengefasst werden. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob Cys-loop-Rezeptoren durch Ubiquitinierung modifiziert werden können. Ubiquitin ist ein kleines intrazelluläres Protein, welches zelluläre Proteine nicht nur für den proteolytischen Abbau durch das Proteasom, sondern auch für die endozytotische Entfernung aus der Plasmamembran markieren kann. In diesem Zusammenhang wurde auch untersucht, ob die E3-Ligase Parkin eine solche Ubiquitinierung vermitteln kann. Für die Klärung dieser Fragen wurden cDNA-Konstrukte der folgenden Proteine in einen für die Oozyten-Expression geeigneten Vektor umkloniert: Parkin, Synphilin, GABAA-a1-, GABAA-b2- und GABAA-g2-Untereinheit sowie für weiterführende Untersuchungen Plic-1 und GABARAP. Ein Teil dieser Konstrukte wurde mit Codons für eine Hexahistidylsequenz versehen. Als zelluläres Expressionssystem wurden Xenopus-Oozyten verwendet, in welchen die Konstrukte mittels cRNA-Injektion exprimiert wurden. Während der Biosynthese wurden die Proteine mit L-[35S]-Methionin metabolisch markiert. Hexahistidylmarkierte Proteine wurden über Ni2+-NTA-Agarose, GST-Fusionsproteine über GSH-Sepharose aufgereinigt. Die aufgereinigten Proteine wurden mittels SDS-PAGE, SDS-Tricin-PAGE oder Blauer-nativer-PAGE aufgetrennt und anschließend durch Detektion der Radioaktivität mit Hilfe eines PhosphorImagers dargestellt. Die Blaue-native-PAGE-Analyse ergab, dass die alleine exprimierte und unter nativen Bedingungen aufgereinigte GABAA-a1-Untereinheit in der Zelle in Form von Homotrimern vorliegt und nicht in der Lage ist, die für Cys-loop-Rezeptoren typische pentamere Assemblierungsstufe zu erreichen. Koexpression mit der GABAA-b2-Untereinheit führte dagegen zu a1/b2-Heteropentameren, d.h. der für funktionelle Cys-loop-Rezeptoren typischen pentameren Architektur. Dieses Assemblierungsverhalten spiegelt das aus elektrophysiologischen Untersuchungen bekannten Phänomen wieder, dass GABAA-alpha1-Untereinheiten für sich alleine nicht in der Lage sind, funktionelle homomere Rezeptoren auszubilden. Im Gegensatz zur GABAA-alpha1-Untereinheit konnte die GlyR-alpha1-Untereinheit auch bei alleiniger Expression zu Homopentameren assemblieren. Um eine mögliche Ubiquitinierung nachzuweisen, wurde GST-Ubiquitin in Xenopus-Oozyten vorinjiziert und anschießend der jeweils gewünschte Cys-Loop-Rezeptor durch cRNA-Injektion exprimiert. Nach [35S]Methionin-Markierung wurde GST-Ubiquitin samt assoziierter Proteine über GSH-Affinitätschromatografie aus den Xenopus-Oozyten isoliert und auf einem SDS-PAGE-Gel analysiert. Eine Bildung eines kovalenten Adduktes zwischen Rezeptor und GST-Ubiquitin wurde für den alpha1-GlyR, nicht aber für andere Cys-Loop-Rezeptoren (alpha1/beta2-GABAAR, alpha7-nAChR) gefunden. Eine alpha1-GlyR-Mutante, bei der sämtliche intrazellulär lokalisierten Lysinreste durch Arginine ersetzt worden waren, wurde ebenfalls nicht ubiquitiniert. Dieser Befund belegt eindeutig, dass Ubiquitin kovalent an Lysinreste auf der großen zytoplasmatischen Schleife zwischen den Transmembrandomänen TM3 und TM4 der GlyR alpha1-Untereinheit gebunden wird. Die zusätzliche Expression von Parkin, einer Ubiquitin-E3-Ligase, resultierte in keiner verstärkte Ubiquitinierung des alpha1-GlyRs, ergab jedoch Hinweise auf eine physische Interaktion zwischen alpha1-GlyR und Parkin. Dagegen konnte die Beobachtungen von Chung et al. (Nature Medicine 7, 1108-09, 2001) bezüglich einer Interaktion von Parkin und Synphilin nicht bestätigt werden.This thesis dealt with the possibility of modification of cys-loop-receptors by ubiquitination, especially the Glycine-receptor and GABA-receptor. Ubiquitin is a small intracellular protein, which marks other cellular proteins for proteolytic degradation by the proteasome on the one hand and for endocytic elimination from the plasma membrane on the other hand. In this context the theory of the E3-ligase Parkin mediating ubiquitination was examined but could not be proved. Blue-native-PAGE-analysis showed that the GABAA-a1-subunits assemble as homotrimers and not as pentamers what is known of cys-loop-receptors. Coexpression of GABAA-a1 and GABAA-b2-subunits showed the typical pentamer assembly. In contrast to this Glyince-alpha1-subunits showed their ability to assemble in pentamers. Moreover the formation of a covalent adduct between the alpha1-subunit of the Glycine-receptor and GST-ubiquitin which was dependant on lysines of the intracellular loop of the alpha1-subunit could be demonstrated in this thesis.
OpenAccess: 
PDF
(additional files)
Dokumenttyp
Dissertation / PhD Thesis
Format
online, print
Sprache
German
Externe Identnummern
HBZ: HT014925315
Interne Identnummern
RWTH-CONV-114745
Datensatz-ID: 52529
Beteiligte Länder
Germany
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