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Raman spectroscopy in biological tissue
Influence of absorption and scattering and detection of cervical precancer
Reble, Carina
Die Anwendung von Raman Spektroskopie für die Analyse von biologischem Gewebe erfreut sich derzeit wachsender Beliebtheit, da diese nicht-invasiv Informationen über die molekulare Zusammensetzung des Gewebes liefert. Diese Arbeit umfasst eine methodische Analyse über den Einfluss von Absorption und Streuung auf die Intensität des Signals und die Messtiefe, ebenso wie eine Studie zur Erkennung von Präkanzerosen des Gebärmutterhalses mittels großflächiger Ramanspektroskopischer Abrasterung. Der Einfluss von Absorption und Streuung auf die Signalintensität und die Messtiefe wurde mit Monte Carlo (MC) Simulationen und Messungen an Gewebemodellen untersucht. Die Ergebnisse sind relevant für den Vergleich und die Interpretation von Messung an Proben mit unterschiedlicher Absorption und Streuung sowie Messungen mit verschiedenen Messgeometrien. Die Abhängigkeit der Signalintensität vom Absorptionskoeffizienten µ_a und dem reduzierten Streukoeffizienten µ'_s wurde hauptsächlich durch den Radius und Abstand des Anregungs- und Detektionskegels auf der Gewebeoberfläche bestimmt. Bei einer Beleuchtung mit Nadelstrahl und einem halbunendlichen Detektor war die Signalintensität proportional zu 1/µ_a und der Einfluss der Streuung gering. Bei Werten von µ_a und µ'_s wie sie typisch für Gewebe im nahinfraroten Spektralbereich (NIR) sind, wurde die Messtiefe hauptsächlich vom Streukoeffizienten bestimmt. Um den Einfluss von µ_a und µ'_s auf die gemessene Intensität zu korrigieren wurden verschiedene Methoden anhand simulierter Ramansignale verglichen. Ein Verfahren mittels simulierter Lookup-Tabelle für Korrekturfaktoren stellte sich als vorteilhaft heraus. Zwecks Anwendung auf In-vivo-Ramansignale von Karotinoiden in der Haut wurden die Korrekturmethoden durch Messungen an Gewebemodellen evaluiert. Die Korrektur mittels Division durch das Remissionssignal reduzierte die relative Standardabweichung (RSD) von 88% auf 58%, die Korrektur mittels Lookup-Tabelle reduzierte die RSD auf 16%. Für Messungen an Haut wurde ein Aufbau zur kombinierten Messung von Ramanspektren und optischen Eigenschaften konstruiert. Angewendet auf In-vivo-Ramanspektren vom Handballen zeigte sich ein durchschnittlicher Korrektureffekt von 18% (n=9). Bei Haut können jedoch verschiedene Hautschichten mit unabhängig variierendem µ_a und µ'_s und verschiedenen Karotinoidkonzentration zum gemessenen Signal beitragen. Simulationen eines Zweischichtmodells von Haut zeigten, dass bei variierendem µ_a und konstantem µ'_s die Korrektur mittels Division durch die Remission die RSD für alle untersuchten Fälle der Karotinoidverteilung reduziert. Treten jedoch zusätzlich Variationen von µ'_s auf, war das Verfahren mit Lookup-Tabelle am erfolgreichsten. MC Simulationen wurden auch benutzt um die Messtiefe eines NIR Ramanscanners zur Ex-vivo-Analyse von Konisationspräparaten vorherzusagen und das Optikdesign entsprechend zu wählen. In bisherigen Studien wurde die erfolgreiche kolposkopisch geführte Erkennung von Präkanzerosen am humanen Gebärmutterhals durch punktweise Messungen mit Fasersonden gezeigt. Mit dem langfristigen Ziel einer großflächigen In-vivo-Bildgebung wurden in dieser Studie Rastermessungen mit durchschnittlich 200 Spektren pro Konisat durchgeführt. Die diagnostische Genauigkeit wurde mittels histopathologischem Mapping bewertet und abhängig von den in die Analyse eingeschlossenen Gewebepathologien bestimmt. Dafür wurde die durchschnittliche Genauigkeit verschiedener Verfahren verwendet, welche sich nicht signifikant voneinander unterscheiden. Die höchste Sensitivität (89%) und Spezifität (84%) (n=16) wurde für die Diskriminierung von normalem Plattenepithel und hochgradigen Präkanzerosen erzielt. Wenn weitere Messungen nicht-hochgradiger Gewebeveränderungen wie Zylinderepithel, Metaplasie und Entzündungen eingeschlossen wurden, verringerte sich die diagnostische Genauigkeit.
Raman spectroscopy is increasingly used for the analysis of biological tissue due to its capability to gain information about the molecular constitution non-invasively. This thesis comprises a methodological analysis on the effects of absorption and scattering on Raman intensity and measurement depth as well as a clinical study on the detection of cervical precancer with macro raster scans. The influence of tissue absorption and elastic scattering on the Raman intensity and on the sampling depth was investigated with Monte Carlo (MC) simulations and tissue phantom measurements. The results are relevant for the comparison and interpretation of measurements with varying absorption and scattering or different measurement geometries. The dependence of the intensity on the absorption coefficient µ_a and the reduced scattering coefficient µ'_s was mainly determined by the radius of and the distance between excitation and detection area on the tissue surface. For example, for pencil beam excitation and semi-infinite detection area, the intensity was proportional to 1/µ_a and the influence of µ'_s was fairly small. For µ_a and µ'_s typical of the near infrared wavelength range (NIR, µ_a = 0.01 – 0.1 mm^-1 and µ'_s = 0.5 – 5mm^-1), the shape of the sampling volume was mainly determined by the scattering coefficient. In order to correct for effects of µ_a and µ'_s on the intensity, different correction methods were evaluated using simulated data in a parameter range relevant for measurements in the NIR and the visible wavelength range (VIS). The use of a lookup table-based correction function was found to be advantageous. For the application in in vivo Raman analysis of skin carotenoids, experimental evaluation of correction methods was performed with measurements on tissue phantoms with varying µ_a and µ'_s containing ß-carotene, since an in vivo evaluation requires invasive high performance liquid chromatography (HPLC) measurements of the carotenoid concentration. Correction using the ratio of Raman and diffuse reflectance signal reduced the relative standard deviation (RSD) from 88% to 58% and a lookup table-based correction reduced the RSD to 16%. For in vivo measurements of skin, a setup was designed and constructed for the combined measurement of Raman scattering and spatially resolved reflectance for the determination of optical properties. The average change in Raman intensity of carotenoids due to the correction was 18% (n = 9) for values measured on the palm. However, since the 63% sampling depth of a common setup for skin carotenoid detection was determined to be around 0.4 mm, different tissue layers with independent changes of µ_a and µ'_s and different carotenoid concentration may contribute to the signal. Since these influences cannot be separated in vivo, Monte Carlo simulations were performed with a two-layer skin model. For correcting effects of varying µ_a (with constant µ'_s ), a ratio of Raman and reflectance signal significantly reduced the variation of the measured Raman intensity for all Raman scatterer distributions. If both µ'_s and µ_a vary, the best correction method choice was the lookup table-based correction. MC simulations were further used to guide the design of a NIR Raman scanner for ex vivo tissue analysis. Raman spectroscopy-based discrimination of cervical precancer and normal tissue has been shown previously in vivo with point-wise fiber probe-based measurements of colposcopically selected sites. With a view to the development of in vivo large area imaging, macro raster scans of native cervical cone biopsies with an average of 200 spectra per sample (n=16) was implemented in this study. The diagnostic performance was evaluated using histopathological mapping of the cervix surface depending on the tissue pathologies included in the analysis. The average performance of unsignificantly different classification procedures was used for this comparison. The highest sensitivity (89%) and specificity (84%) was obtained for the discrimination of normal squamous epithelium and high grade precancer. When other non-high grade tissue sites such as columnar epithelium, metaplasia, and inflammation were included, the diagnostic performance decreased.
