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Martin Brinek

• The finite nature of fossil resources and the environmental problems caused by their excessive usage requires alternative approaches. The transformation from a fossil based economy to one based on renewable biomass is called a “bioeconomy”. To substitute fossil resources, various microorganisms have already been modified for the biosynthesis of valuable chemicals from biomass. However, the development of such efficient microorganisms at an industrial scale, remains a major challenge. The most prominent and robust microorganism for industrial production is the yeast Saccharomyces cerevisiae, which is known to produce ethanol that is used as renewable biofuel. However, S. cerevisiae is also naturally able to produce isobutanol in small amounts. Isobutanol is favoured as a biofuel compared to ethanol due to its higher octane number and lower hygroscopicity, which makes it more suitable for application in conventional combustion engines. In S. cerevisiae, the biosynthesis of isobutanol is permitted by the combination of mitochondrial valine synthesis (catalysed by Ilv2, Ilv5 and Ilv3) and its cytosolic degradation (catalysed by Aro10 and Adh2). The different compartmentalisation of the two pathways limit isobutanol biosynthesis. Thus, Brat et al. (2012) were able to increase the isobutanol yield up to 15 mg/gGlc by cytosolic re localisation of the enzymes Ilv2Δ54, Ilv5Δ48 and Ilv3Δ19 (cyt-ILV), with simultaneous deletion of ilv2. This corresponds to approximately 3.7% of the theoretical yield of 410 mg/gGlc, implying existing limitations in isobutanol biosynthesis, which have been investigated in this work. For yet unknown reasons, isobutanol was only produced by S. cerevisiae in a valine free medium, according to Brat et al. (2012). This work shows that this can be attributed to the catalytic activity of Ilv2Δ54, which acted as growth inhibitor to S. cerevisiae. By this logic, a negative selection on the ILV2∆54 gene was exerted, which made the ilv2 deletion and simultaneous valine exclusion necessary to maintain the functional expression of toxic ILV2∆54. Furthermore, it was shown that valine exclusion is not mandatory due to the feedback regulation of Ilv2, permitted by Ilv6. Rather, increased isobutanol yield was observed when cytosolic Ilv6∆61 was expressed in the valine free medium, which is explained by the enhanced regulation of Ilv2Δ54 by Ilv6∆61 when BCAA are absent. Isobutanol biosynthesis is neither redox nor NAD(P)H co factor balanced. It was seen that co factor imbalance could be mitigated by the expression of an NADH oxidase (NOX), but not by expression of the NADH dependent ilvC6E6, since the latter showed low in vivo activity. Furthermore, it was seen that NAD(H) imbalance did already limit isobutanol biosynthesis, but the NADP(H) imbalance did not. Another limitation of cytosolic isobutanol biosynthesis is the secretion of the intermediate 2‑dihydroxyisovalerate, which then no longer is taken up by S. cerevisiae, causing a reduced isobutanol yield. This is attributed to insufficient Ilv3∆19 activity, due to poor iron sulphur cluster apo protein maturation. Therefore, it was aimed to replace Ilv3∆19 by heterologous dihydroxyacid dehydratases. Even though some of the enzymes were functionally expressed, none showed better in vivo activity than Ilv3∆19. Therefore, the Ilv3∆19 apo protein maturation was improved. This was achieved by the genomic deletion of fra2 or pim1 as well as by the cytosolic expression of Grx5∆29. In addition to the isobutanol pathway, S. cerevisiae was optimised for isobutanol biosynthesis by rational and evolutionary engineering. For this purpose, the genes which are necessary for isobutanol production were integrated into the ilv2 locus, and the resulting strain was evolved in a medium containing the toxic amino acid analogue norvaline. Evolved single colonies were isolated, which presented improved growth and increased isobutanol yields (0.59 mg/gGlc) in a valine free medium, as compared to the initial strain. This is explained by a gene dosage effect which occurred during the evolutionary engineering experiment. In collaboration with Dr. Wess, the genes ilv2, bdh1/2, leu4/9, ecm31, ilv1, adh1, gpd1/2 and ald6 were cumulatively deleted in CEN.PK113 7D to block competing metabolic pathways. The resulting strain JWY23 achieved isobutanol yields up to 67.3 mg/gGlc, when expressing the cyt ILV enzymes from a multi copy vector. The most promising approaches of this work, namely the deletion of fra2 and the expression of Grx5∆29, Ilv6∆61, and NOX, were confirmed in this JWY23 strain. The highest isobutanol yield from this work was observed at 72 mg/gGlc for Ilv6∆61 and cyt ILV enzymes expressing JWY23, which corresponds to 17.6% of the theoretical isobutanol yield. Isobutyric acid (IBA) is a by product of isobutanol biosynthesis, but it is also considered a valuable platform chemical. Therefore, the approaches that improved isobutanol biosynthesis were applied to the biosynthesis of IBA in S. cerevisiae. The highest IBA yield of 9.8 mg/gGlc was observed in a valine free medium by expression of cyt ILV enzymes, NOX and Ald6 in JWY04 (CEN.PK113 7D Δilv2; Δbdh1; Δbdh2; Δleu4; Δleu9; Δecm31; Δilv1). This corresponded to an 8.9 fold increase compared with the control and is, to our best knowledge, the highest IBA yield reported to date for S. cerevisiae.
• Die Endlichkeit fossiler Rohstoffe sowie die durch deren Nutzung verursachten Umweltprobleme erfordern alternative Ansätze. Die Transformation der fossilen Wirtschaft zu einer auf erneuerbarer Biomasse basierenden Wirtschaft nennt man "Bioökonomie". Die Entwicklung neuer Mikroorganismen zur Biosynthese von Chemikalien aus Biomasse ist dabei eine zentrale Herausforderung. Es wurden bereits verschiedene Mikroorganismen für die Biosynthese gewünschter Chemikalien modifiziert. Der bekannteste Organismus für die industrielle Biosynthese ist die Hefe Saccharomyces cerevisiae, welche vor allem für die industrielle Produktion von Bioethanol als Benzinersatz bekannt ist. S. cerevisiae bildet allerdings in geringen Mengen auch Isobutanol; dieses wäre als Benzinersatz besser geeignet. Isobutanol wird durch Kombination der mitochondriellen Valin Biosynthese (katalysiert durch Ilv2, Ilv5, Ilv3 und Bat1/2) sowie dessen cytosolischen Abbau durch den Ehrlichstoffwechselweg (katalysiert durch bspw. Aro10 und Adh2) gebildet. Die unterschiedliche Kompartimentierung beider Stoffwechselwege limitierte die Isobutanol Biosynthese, weshalb Brat et al. (2012) durch cytosolische Relokalisierung der Enzyme Ilv2Δ54, Ilv5Δ48 und Ilv3Δ19 (abgekürzt als cyt ILV) bei gleichzeitiger Deletion von ilv2 die Isobutanol Ausbeute steigerte. Die so maximal erzielte Ausbeute entspricht etwa 3,7% der theoretischen Ausbeute von 410 mg/gGlc, was auf bestehende Limitationen bei der Isobutanol Biosynthese hindeutet. Diese wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersucht. Aus bisher ungeklärten Gründen wird Isobutanol gemäß Brat et al. (2012) effizient nur in valinfreiem Medium gebildet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass dies auf die katalytische Aktivität von Ilv2Δ54 zurückzuführen ist, welche toxisch wirkt. Dadurch wird eine negative Selektion auf das ILV2∆54 Gen ausgeübt. Diese macht eine ilv2 Deletion bei gleichzeitigem Valin Ausschluss notwendig, um das toxische Gen funktionell zu exprimieren. Der Valin Ausschluss ist daher nicht, wie bisher angenommen, auf die von Ilv6 erzeugte Endprodukt Hemmung zurückzuführen. Vielmehr wurde eine erhöhte Isobutanol Ausbeute bei Expression von zytosolischen Ilv6∆61 in valinfreiem Medium beobachtet, was auf die positive Regulation von Ilv2Δ54 durch Ilv6∆61 zurückgeführt wird. Weiterhin wurde gezeigt, dass das durch die NADPH abhängige Ilv5Δ54 verursachte Co-Faktor Ungleichgewicht der Isobutanol Biosynthese besser durch Expression einer NADH Oxidase (NOX) als durch die Expression der NADH abhängigen ilvC6E6 gelöst werden konnte, da letzteres eine geringe in vivo Aktivität besaß. Untersuchungen der Co Faktor Ungleichgewichte zeigten, dass das NAD(H) Ungleichgewicht bereits limitierend auf die Isobutanol Biosynthese wirkte, nicht aber das NADP(H) Ungleichgewicht. Eine weitere Limitierung bei der zytosolischen Isobutanol Biosynthese bildet sekretiertes DIV, welches von S. cerevisiae nicht mehr aufgenommen werden kann und somit zu geringeren Isobutanol Ausbeuten führt. Dies wird auf eine geringe Ilv3∆19 Aktivität durch unzureichende Apo Proteinbeladung mit Eisen Schwefel Clustern (ISC) zurückgeführt. Daher wurde versucht, Ilv3∆19 durch heterologe DHAD zu ersetzen. Trotz funktioneller Expression einiger DHADs, besaß keine eine bessere in vivo Aktivität als Ilv3∆19. Im anschließenden Versuch, die Ilv3∆19 Apo Proteinbeladung mit ISC zu optimieren, gelang dies sowohl durch die Deletion von fra2 oder pim1 wie auch durch die Expression von cytosolischem Grx5∆29. Neben dem Isobutanol Stoffwechselweg selbst wurde auch S. cerevisiae mittels evolutionärem Engineering für die Isobutanol Biosynthese optimiert. Dazu wurden die notwendigen Gene in den ilv2 Locus integriert und die Mutante anschließend in norvalinhaltigem Medium evolviert. So evolvierte Einzelklone besaßen verbesserte Wachstumseigenschaften in valinfreiem Medium sowie eine erhöhte Isobutanol Ausbeute (0,59 mg/gGlc) gegenüber dem Ausgangstamm, was auf einen Gendosierungseffekt zurückgeführt wird. Zusätzlich wurden in Zusammenarbeit mit Dr. J. Wess die Gene konkurrierender Stoffwechselwege kumulativ deletiert. Der daraus resultierende Stamm JWY23 erzielte durch Expression von cyt ILV eine Isobutanol Ausbeute von 67,3 mg/gGlc. Die vielversprechendsten Ansätze dieser Arbeit, nämlich die Deletion von fra2 sowie die Expression von Grx5∆29, Ilv6∆61 und NOX, wurden im JWY23 Hintergrund bestätigt. Die höchste Isobutanol Ausbeute dieser Arbeit wurde mit 72 mg/gGlc für den cyt ILV und Ilv6∆61 exprimierenden JWY23 Stamm beobachtet, was 17,6% der theoretischen Ausbeute entspricht. Isobuttersäure (IBA) ist ein Nebenprodukt der Isobutanol Biosynthese, welches jedoch als werthaltige Plattformchemikalie gilt. Daher wurden die Erkenntnisse aus dieser Arbeit für die Biosynthese von IBA im Zytosol von S. cerevisiae verwendet. Die höchste IBA Ausbeute von 9,8 mg/gGlc wurde in valinfreiem Medium durch Expression von cyt ILV, NOX und Ald6 in JWY04 beobachtet. Dies entsprach einer 8,9 fachen Steigerung gegenüber der Kontrolle und ist nach unserem Kenntnisstand die höchste IBA Ausbeute, die bisher für S. cerevisiae berichtet wurde.