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Leonie Baumann

• Octanoic acid (C8 FA) is a medium-chain fatty acid which, in nature, mainly occurs in palm kernel oil and coconuts. It is used in various products including cleaning agents, cosmetics, pesticides and herbicides as well as in foods for preservation or flavoring. Furthermore, it is investigated for medical treatments, for instance, of high cholesterol levels. The cultivation of palm oil plants has surged in the last years to satisfy an increasing market demand. However, concerns about extensive monocultures, which often come along with deforestation of rainforest, have driven the search for more environmentally friendly production methods. A biotechnological production with microbial organisms presents an attractive, more sustainable alternative. Traditionally, the yeast Saccharomyces cerevisiae has been utilized by mankind in bread, wine, and beer making. Based on comprehensive knowledge about its metabolism and genetics, it can nowadays be metabolically engineered to produce a plethora of compounds of industrial interest. To produce octanoic acid, the cytosolic fatty acid synthase (FAS) of S. cerevisiae was utilized and engineered. Naturally, the yeast produces mostly long-chain fatty acids with chain lengths of C16 and C18, and only trace amounts of medium-chain fatty acids, i.e. C8-C14 fatty acids. To generate an S. cerevisiae strain that produces primarily octanoic acid, a mutated version of the FAS was generated (Gajewski et al., 2017) and the resulting S. cerevisiae FASR1834K strain was utilized in this work as a starting strain. The goal of this thesis was to develop and implement strategies to improve the production level of this strain. The current mode of quantification of octanoic acid includes labor-intensive, low-throughput sample preparation and measurement – a main obstacle in generating and screening for improved strain variants. To this end, a main objective of this thesis was the development of a biosensor. The biosensor was based on the pPDR12 promotor, which is regulated by the transcription factor War1. Coupling pPDR12 to GFP as the reporter gene on a multicopy plasmid allowed in vivo detection via fluorescence intensity. The developed biosensor enabled rapid and facile quantification of the short- and medium-chain fatty acids C6, C7 and C8 fatty acids (Baumann et al., 2018). This is the first biosensor that can quantify externally supplied octanoic acid as well as octanoic acid present in the culture supernatant of producer strains with a high linear and dynamic range. Its reliability was validated by correlation of the biosensor signal to the octanoic acid concentrations extracted from culture supernatants as determined by gas chromatography. The biosensor’s ability to detect octanoic acid in a linear range of 0.01-0.75 mM (≈1-110 mg/L), which is within the production range of the starting strain, and a response of up to 10-fold increase in fluorescence after activation was demonstrated. A high-throughput FACS (fluorescence-activated cell sorting) screening of an octanoic acid producer strain library was performed with the biosensor to detect improved strain variants (Baumann et al., 2020a). For this purpose, the biosensor was genomically integrated into an octanoic acid producer strain, resulting in drastically reduced single cell noise. The additional knockout of FAA2 successfully prevented medium-chain fatty acid degradation. A high-throughput screening protocol was designed to include iterative enrichment rounds which decreased false positives. The functionality of the biosensor on single cell level was validated by adding octanoic acid in the range of 0-80 mg/L and subsequent flow cytometric analysis. The biosensor-assisted FACS screening of a plasmid overexpression library of the yeast genome led to the detection of two genetic targets, FSH2 and KCS1, that in combined overexpression enhanced octanoic acid titers by 55 % compared to the parental strain. This was the first report of an effect of FSH2 and KCS1 on fatty acid titers. The presented method can also be utilized to screen other genetic libraries and is a means to facilitate future engineering efforts. In growth tests, the previously reported toxicity of octanoic acid on S. cerevisiae was confirmed. Different strategies were harnessed to create more robust strains. An adaptive laboratory evolution (ALE) experiment was conducted and several rational targets including transporter- (PDR12, TPO1) and transcription factor-encoding genes (PDR1, PDR3, WAR1) as well as the mutated acetyl-CoA carboxylase encoding gene ACC1S1157A were overexpressed or knocked out in producer or non-producer strains, respectively. Despite contrary previous reports for other strain backgrounds, an enhanced robustness was not observable. Suspecting that the utilized laboratory strains have a natively low tolerance level, four industrial S. cerevisiae strains were evaluated in growth assays with octanoic acid and inherently more robust strains were detected, which are suitable future production hosts. ...
• Octansäure (C8 Fettsäure) ist eine mittelkettige Fettsäure, die in der Natur vor allem in Palmkernöl und Kokosnüssen vorkommt. Sie wird in verschiedenen Produkten wie Reinigungsmitteln, Kosmetika, Pestiziden und Herbiziden, sowie in Lebensmitteln zur Konservierung oder zum Aromatisieren eingesetzt. Darüber hinaus wird die Anwendung von Octansäure zur medizinischen Behandlung, z. B. von hohen Cholesterinwerten, untersucht. Um die seit Jahren steigende Nachfrage zu decken, hat der Anbau von Öl- und Kokospalmen in den letzten Jahren kontinuierlich zugenommen. Der Anbau insbesondere von Ölpalmen erfolgt oft in großflächigen Monokulturen, für welche Regenwald abgeholzt wird. Die damit einhergehende Umweltproblematik ist zunehmend im Fokus der Öffentlichkeit und befördert die Suche nach umweltfreundlicheren Produktionsmethoden. Eine biotechnologische Produktion mit Mikroorganismen wie Hefe, stellt dabei eine attraktive, nachhaltigere Alternative dar Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wird seit Jahrtausenden für die Herstellung von Brot, Wein und Bier genutzt. Heutzutage kann basierend auf umfassenden Kenntnissen über Stoffwechsel und Genetik, der Metabolismus der Hefe so verändert werden, dass die Produktion einer Vielzahl von industriell relevanten Produkten möglich ist. Zur Herstellung von Octansäure wurde die zytosolische Fettsäuresynthase (FAS, fatty acid synthase) von S. cerevisiae genutzt. Natürlicherweise produziert Hefe im FAS-Zyklus hauptsächlich langkettige Fettsäuren mit Kettenlängen von C16 und C18, und nur geringe Mengen mittelkettiger Fettsäuren (C8-C14). Um einen S. cerevisiae-Stamm mit einem veränderten Fettsäurespektrum zu erzeugen, wurden die FAS-kodierenden Gene entsprechend verändert. Die hierbei erzeugte Variante FASR1834K bringt die Hefe zur vermehrten Produktion von Octansäure (Gajewski et al., 2017). Die Hefe produziert Octansäure im FAS-Zyklus und entlässt diese zunächst in ihrer aktivierten Form, dem Octanoyl-CoA. Dieses wird anschließend durch Thioesterasen gespalten, die Octansäure freigesetzt, und von der Zelle ins Medium abgegeben. Der FASR1834K-Hefestamm diente als Ausgangsstamm für die vorliegende Arbeit. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Grundlagen für eine Verbesserung der Octansäureproduktion in Hefe zu schaffen. Die Erhöhung der Octansäuretiter und -ausbeuten ist die Voraussetzung für eine wirtschaftlich rentable Herstellung im industriellen Maßstab. Eine der Herausforderungen hierbei ist die arbeitsintensive, durchsatzarme Probenvorbereitung und -messung von der Octansäure aus den produzierenden Hefen. Um diese zu vereinfachen und beschleunigen, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Biosensor für Octansäure entwickelt. Biosensoren ermöglichen die Erkennung kleiner Moleküle in Hefezellen, worauf diese mit einer spezifischen Regulierung der Genexpression reagieren. Im Fall eines GFP (green fluorescent protein) -gekoppelten Biosensors wird dies durch eine Veränderung der Fluoreszenz messbar...