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Anna Larissa Engel

• Das Glioblastom ist der häufigste bösartige primäre Hirntumor im Erwachsenenalter. Trotz intensiver Forschungsbemühungen inklusive zahlreicher Therapiestudien liegt die mediane Gesamtüberlebenszeit selbst von Patienten in gutem Allgemeinzustand noch immer unter zwei Jahren. Deshalb ist die Erforschung möglicher Resistenzmechanismen sowie neuer therapeutischer Angriffspunkte dringend erforderlich, um effizientere Therapien zu entwickeln. Insbesondere der Tumormetabolismus hat in den vergangenen Jahren an Bedeutung in der Krebsforschung gewonnen. Hier zeigte sich in anderen Tumorentitäten, dass der Metabolismus der Aminosäure Serin, insbesondere des Schlüsselenzyms der Serin-Biosynthese, der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase (PHGDH), ein Ansatzpunkt für neue Therapien sein kann. Wir stellten uns die Frage, ob auch im Glioblastom der Serinstoffwechsel von Bedeutung für Wachstum und Überleben der Tumorzellen ist und ob dieser somit einen neuen therapeutischen Angriffspunkt darstellen kann. Zur Untersuchung dieser Fragestellung wurden initial verschiedene Tumorzelllinien hinsichtlich ihrer basalen Expression von PHGDH und weiterer Schlüsselenzyme des Serinstoffwechsels auf mRNA- und Protein-Ebene analysiert. Anschließend wurde untersucht, ob sich die Expression dieser Enzyme durch Zellstress verändert. Zur weiteren Evaluierung der PHGDH als möglichem Ansatz für neue Therapien wurde deren Aktivität pharmakologisch und genetisch inhibiert. In Wachstumsanalysen wurde ferner die Abhängigkeit der Zellen von verschiedenen Serinquellen untersucht. Unter Bedingungen des Tumormikromilieus wurden Zelltod- und Redox-Stress-Parameter untersucht. Abschließend wurden die Ergebnisse durch eine PHGDH-Überexpression validiert. Die basalen Expressionsniveaus der PHGDH unterschieden sich in den fünf analysierten Gliomzelllinien. Es zeigte sich keine Korrelation mit der Expression der Serinhydroxymethyltransferase 1 und 2 (SHMT 1 und 2, zytoplasmatische bzw. mitochondriale Isoform), welche ebenfalls Schlüsselenzyme im Serinstoffwechsel sind. Unter Zellstress, welcher mittels Hypoxie oder Aktivierung des Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) induziert wurde, zeigte sich ein Anstieg der Expression von PHGDH und SHMT2. Im nächsten Schritt erfolgten Versuche mit CBR-5884, einem pharmakologischen Inhibitor der PHGDH. CBR-5884 reduzierte signifikant die intrazellulären Serin- und Glycin-Spiegel. Parallel zeigte sich eine dosisabhängige, signifikante Reduktion des Zellwachstums in allen getesteten Linien, ohne eine Induktion von Zelltod. Zelllinien mit niedriger PHGDH-Expression wurden zusätzlich bereits durch Entzug von Serin aus dem Kulturmedium signifikant in ihrem Wachstum gehemmt. Unter realistischen Bedingungen des Tumormikromilieus mit Sauerstoff- und Nährstoffmangel zeigte sich unter zusätzlicher PHGDH-Inhibition mittels CBR-5884 ein signifikanter Anstieg von Zelltod-Parametern und reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) einhergehend mit einer reduzierten NADPH/NADP+-Ratio. Die Ergebnisse der pharmakologischen PHGDHInhibition konnten durch eine PHGDH-Gensuppression reproduziert werden. Umgekehrt bestätigte eine genetische PHGDH-Überexpression den protektiven Effekt eines aktiven Serinmetabolismus für die Tumorzellen. Zusammenfassend zeigte sich in unseren Versuchen, dass unter Bedingungen des Tumormikromilieus einige Gliomzell-Linien den Serinmetabolismus induzieren, was einen protektiven Effekt für das Überleben unter widrigen Mikromilieusbedingungen zu haben scheint. Umgekehrt reduzierte eine Inhibition der PHGDH als Schlüsselenzym der Serinsynthese unter diesen Bedingungen das Wachstum von Glioblastom-Zellen und induzierte gleichzeitig Zelltod und Redoxstress. Diese Ergebnisse rechtfertigen eine weitere präklinische Testung in in vivo Modellen. Zusammenfassend legen unsere Ergebnisse nahe, dass der Serinmetabolismus einen vielversprechenden Angriffspunkt für neue Therapiestrategien im Glioblastom darstellen könnte.
• Glioblastoma is the most common malignant primary brain tumour in adulthood. Despite intensive research efforts including numerous therapy studies, the median overall survival of patients even in good clinical conditions remains below two years. Therefore, research into possible resistance mechanisms as well as new therapeutic targets are urgently needed in order to develop more efficient therapeutic approaches. Tumour metabolism has achieved increasing relevance in cancer research within the last years. In other tumour entities, it has been shown that the metabolism of the amino acid serine, in particular of the key enzyme of serine biosynthesis, 3- phosphoglycerate dehydrogenase (PHGDH), may represent a new therapeutic target. We asked ourselves whether serine metabolism is also of importance for growth and survival of glioblastoma cells and whether it can thus represent a new therapeutic target. To investigate this question, we initially analysed different tumour cell lines regarding their basal expression of PHGDH and other key enzymes of the serine metabolism on mRNA and protein level. Subsequently, it was investigated whether the expression of these enzymes is altered by cell stress. For further evaluation of PHGDH as a possible therapeutic target, its activity was pharmacologically and genetically inhibited. In growth analyses, the dependency of the cells on various serine sources was investigated. Cell death and redox stress parameters were investigated under conditions of the tumour microenvironment. Finally, the results were validated by PHGDH overexpression. The basal expression levels of PHGDH differed in the five analysed glioma cell lines. No correlation was found with the expression of serine hydroxymethyltransferases 1 and 2 (SHMT 1 and 2, cytoplasmic and mitochondrial isoform), which are also key enzymes of serine metabolism. Under cell stress induced by hypoxia or activation of the nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), the expression of PHGDH and SHMT2 was increased. In the next step, experiments were performed with CBR7 5884, a pharmacological inhibitor of PHGDH. CBR-5884 significantly reduced intracellular serine and glycine levels. In parallel, a dose-dependent significant reduction of cell growth was shown in all tested lines without induction of cell death under these conditions. In addition, cell lines with low PHGDH levels were significantly inhibited in their growth by the removal of serine from the culture medium. Under realistic conditions of the tumour microenvironment with oxygen and nutrient deficiency, a significant increase in cell death and reactive oxygen species (ROS) was observed with a reduced NADPH/NADP+ ratio under additional PHGDH inhibition by CBR-5884. The results of pharmacological PHGDH inhibition could be reproduced by PHGDH gene suppression. Conversely, genetic PHGDH overexpression confirmed the protective effect of an active serine metabolism on tumour cells. In conclusion, our experiments showed that under conditions of the tumour microenvironment some tumour cells induce serine metabolism, which thus exerts a protective effect on survival under adverse microenvironmental conditions. Conversely, inhibition of PHGDH, a key enzyme in serine synthesis, reduced growth of glioblastoma cells and simultaneously induced cell death and redox stress under these conditions. These results justify testing in in vivo models. In summary, our results indicate that serine metabolism represents a promising target for new therapeutic strategies to improve treatment for glioblastoma.