Open Access

Elisa Lagostina

• This manuscript-based thesis is divided into four chapters. Chapter one is an introduction to lichens and the Antarctic. It introduces the goal of the thesis and the problems related with lichen systematics and the lack of knowledge about Antarctic lichens. The Antarctic is one of the last wildernesses, isolated from the other continents by the Antarctic Circumpolar Current, the Subantarctic Front, the Antarctic Polar Front, and the Drake Passage. Terrestrial life in Antarctica is restricted to widely separated and small ice-free areas that cover only 0.3% of the continent. Colonization of the Antarctic is a challenge for many taxa and is related to their ability for long-range dispersal and their adaptation to the harsh climate. Antarctic terrestrial ecosystems are significantly threatened by climate change, invasive species, and their interactions. Glacial retreat caused by higher than average temperatures exposes new habitats that can be easily colonized from local biota, but non-native species can also be favored by the new climatic conditions. In addition, propagule movement mediated by humans can introduce new species or change the population structure of many taxa. The terrestrial biota is comprised almost exclusively by “lower organisms” (invertebrates, bryophytes, algae, lichenized fungi, and microorganisms). Lichens are the dominant component, and the most important primary producers. Lichens are symbiotic associations consisting of a fungus (mycobiont) and one or more photosynthetic (photobiont) partners. They can disperse sexually or vegetatively. There are several problems related to the symbiotic nature of lichens that do not facilitate easy identification; although molecular data offers additional evidence, species delimitation in lichens is still not straightforward. The true number of species is underestimated due to the presence of cryptic species and species pairs. Recommended universal fungal barcode sequences (e. g. ITS) sometimes fail to delimit species pairs. Thus, it is necessary to identify fast-evolving markers that allow for the delimitation of closely related species before proceeding with the analysis of lichen populations. The goal of this thesis is to elucidate the so far unknown genetic structure among Antarctic lichen populations because of the immediate consequences for conservation strategies. The thesis focuses not only on patterns of differentiation and gene flow, but also investigates the question of human-mediated propagule transfer into Antarctica and among Antarctic sites. This project provides data on the genetic structure of Antarctic lichens that is urgently needed to develop conservation strategies in the face of global warming and increased human activities in the region. Due to the fact that it is not possible to apply all of the unspecific fingerprinting methods to lichens, microsatellites or simple sequence repeats (SSRs) are one of the best tools to investigate the genetic structure of lichen populations. SSRs offer the possibility to discriminate the lichen partners, but species-specific microsatellites have been developed for only a few species. Regarding the Antarctic, only one species has been studied with SSRs. The second chapter describes new methods and tools to delimit closely related species of lichens and provides fast evolving markers to characterize their genetic structure. The chapter introduces the lichen species analysed in this thesis and the problems related to their correct identification by morphological methods and molecular data. Chapter two explains the sampling methods for lichen populations and the localities from small areas in which the species pairs occur together. Then the methods used to generate and validate fungal specific microsatellites that cross-amplify species pairs are described. This chapter focuses on the species pair Usnea antarctica and U. aurantiacoatra because they are the most common lichens in the Maritime Antarctic. An internal transcribed spacer (ITS) marker do not discriminate between these species, and some authors have suggested to synonymize them. Unpublished results from another Antarctic species pair, Placopsis antarctica and P. contortuplicata, are included to confirm the capability of SSRs to discriminate closely related lichen species. This thesis is the first study to generate SSRs that cross amplify species pairs, using BLAST to compare one genome against the other to obtain markers with the same length in flanking regions. The de novo developed SSRs are able to discriminate the two closely related species, and can detect variability at the population level. In the end of the chapter, ITS sequences, microsatellites, and SNPs are used to delimit the species of Usnea antarctica and U. aurantiacoatra. The chapter exposes the importance of a correct species delimitation and the ability of SSRs and SNPs to delimit the Antarctic Usnea species pair compared with the recommended universal fungal barcode sequence ITS. ...
• Diese manuskriptbasierte Dissertation ist in vier Kapitel unterteilt. Das erste Kapitel ist eine Einführung in die Flechten und die Antarktis. Es führt in das Ziel der Arbeit und die mit der Flechtensystematik und dem mangelnden Wissen über antarktische Flechten verbundenen Probleme ein. Die Antarktis ist eine der letzten vom Menschen weitgehend unbeeinflussten Regionen der Erde und ist von den anderen Kontinenten durch den antarktischen Zirkumpolarstrom, die Subantarktische Front, die Antarktische Polarfront und die Drake-Passage isoliert. Das terrestrische Leben in der Antarktis beschränkt sich auf weit voneinander entfernte und kleine eisfreie Gebiete, die nur 0,3% des Kontinents bedecken. Die Kolonisierung der Antarktis ist für viele Taxa eine Herausforderung und hängt mit ihrer Fähigkeit zur Fernverbreitung und ihrer Anpassung an die raue Klimabedingungen zusammen. Die terrestrischen Ökosysteme der Antarktis sind durch den Klimawandel, das Eindringen invasiver Arten und Wechselwirkungen zwischen diesen Faktoren erheblich bedroht. Der durch überdurchschnittlich hohe Temperaturen verursachte Gletscherrückgang legt neue Lebensräume frei, die leicht von lokalen Biota besiedelt werden können. Aber auch nicht-einheimische Arten können durch die veränderten klimatischen Bedingungen begünstigt werden. Die anthropogene Ausbreitung von Diasporen kann zur Ansiedlung neuer Arten in der Antarktis beitragen oder die Populationsstruktur vieler Taxa verändern. Die terrestrische Biota besteht fast ausschließlich aus "niederen Organismen" (wirbellose Tiere, Moose, Algen, lichenisierte Pilze und Mikroorganismen). Flechten sind die dominierende Komponente und die wichtigsten Primärproduzenten. Sie sind symbiotische Systeme, die aus einem Pilz (Mykobionten) und einem oder mehreren photosynthetischen Partnern (Photobionten) bestehen und können sich sexuell oder vegetativ verbreiten. Die symbiotische Natur der Flechten schafft verschiedene Probleme, die eine einfache Artbestimmung bei Flechten erschweren. Selbst mit molekularen Daten ist die Artabgrenzung bei Flechten noch immer nicht einfach. Die wahre Anzahl der Arten wird aufgrund der Anwesenheit kryptischer Arten und Artenpaaren häufig unterschätzt. Die empfohlenen universellen Marker für das DNA-Barcoding (z. B. ITS) können manchmal keine Artenpaare abgrenzen. Bevor mit der Analyse von Flechtenpopulationen begonnen werden kann, ist es daher notwendig, schnell evolvierende Marker zu finden, die die Abgrenzung eng verwandter Arten ermöglichen. Das Ziel dieser Arbeit ist es, die bisher unbekannte genetische Struktur antarktischer Flechtenpopulationen wegen ihrer unmittelbaren Konsequenzen für den Artenschutz aufzuklären. Die Arbeit konzentriert sich dabei nicht nur auf Differenzierungsmuster und Genfluss, sondern untersucht auch die Frage des vom Menschen vermittelten Diasporentransfers in die Antarktis und zwischen antarktischen Standorten. Sie liefert Daten über die genetische Struktur antarktischer Flechten, die dringend benötigt werden, um angesichts der globalen Erwärmung und der zunehmenden menschlichen Aktivitäten in der Region Artenschutzstrategien zu entwickeln. Da es wegen ihrer symbiontischen Natur nicht möglich ist, unspezifische Fingerprinting-Methoden auf Flechten anzuwenden, sind Mikrosatelliten oder „Simple Sequence Repeats“ (SSRs) eines der besten Werkzeuge zur Untersuchung der genetischen Struktur von Flechtenpopulationen. SSRs ermöglichen es, zwischen den Flechtenpartnern zu unterscheiden, aber artspezifische Mikrosatelliten wurden nur für einige wenige Arten entwickelt. In der Antarktis ist bisher nur eine Art mit SSRs untersucht worden. Das zweite Kapitel beschreibt neue Methoden und Werkzeuge zur Abgrenzung eng verwandter Flechtenarten und präsentiert schnell evolvierende Marker zur Charakterisierung ihrer genetischen Struktur. Das Kapitel stellt die in dieser Arbeit analysierten Flechtenarten und die Probleme im Zusammenhang mit ihrer korrekten morphologischen und molekularen Identifizierung vor. Im zweiten Kapitel wird die Besammlungsmethode erläutert: Probenahme in kleinen Arealen, in denen die Artenpaare gemeinsam vorkommen. Dann werden die Methoden zur Entwicklung und Validierung pilzspezifischer, aber artübergreifend amplifizierender Mikrosatelliten beschrieben. Bei dem Artenpaar Usnea antarctica und U. aurantiacoatra handelt es sich um die häufigsten Flechten in der maritimen Antarktis. Der empfohlene DNA-Barcode für Pilze, der „internal transcribed spacer“ der ribosomalen RNA (ITS) unterscheidet nicht klar zwischen diesen Arten, und einige Autoren haben deshalb vorgeschlagen, die beiden Namen als Synonyme zu betrachten. Um die generelle Eignung von SSRs zur Unterscheidung eng verwandter Flechtenarten zu bestätigen, werden hier auch unveröffentlichte Ergebnisse eines anderen antarktischen Artenpaares, Placopsis antarctica und P. contortuplicata, dargestellt. Diese Arbeit ist die erste Studie, die Draft-Genome zweier Flechtenarten verwendet, um SSR-Marker mit gleicher Länge in flankierenden Regionen zu identifizieren, die über Artgrenzen hinweg amplifizieren. Mit Hilfe der neu entwickelten SSRs ist es möglich, die beiden eng verwandten Arten klar zu unterscheiden und gleichzeitig genetische Variabilität auf Populationsebene zu erfassen. Am Ende des Kapitels werden ITS-Sequenzen, Mikrosatelliten und SNPs zur Abgrenzung der Arten Usnea antarctica und U. aurantiacoatra verwendet. Das Kapitel zeigt die Bedeutung einer korrekten Artabgrenzung und die Vorteile von SSRs und SNPs im Vergleich zu der empfohlenen universellen Pilz-Barcode-Sequenz ITS bei der Abgrenzung antarktischer Usnea-Arten auf. ...