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Josefine Kahlstatt

• Biologischen Systemen liegen Mechanismen zugrunde, die bis heute nicht vollständig aufgeklärt sind. Für die Untersuchung eignen sich externe Trigger, die eine Regulation von außen auf das System erlauben und Prozesse gezielt steuerbar machen. Eine Möglichkeit ist das System unter optische Kontrolle zu bringen, d.h. durch Licht eine externe Steuerung zu implementieren, was von einem internen Chromophor aufgenommen wird. In der vorliegenden Dissertation werden drei individuelle Projekte vorgestellt, die alle dieses Prinzip auf unterschiedliche Weise anwenden. RNAs haben eine Vielzahl an verschiedenen Funktionen in der Zelle, die von der Proteinsynthese bis zur Genregulation variieren. Im ersten Projekt wurde der Photoschalter Spiropyran im Kontext von RNA eingesetzt. Mit dem Ziel das Derivat PyBIPS kovalent an ein Oligonukleotid zu binden und damit die Hybridisierung eines Duplexes zu steuern, wurden Strukturmotive gesucht, an die der Photoschalter postsynthetisch gebunden werden kann. Dabei soll die sterisch anspruchsvolle Spiropyran-Form die Watson-Crick-Basenpaarung stören und die planare, konjugierte Merocyanin-Form in den Duplex, zur zusätzlichen Stabilisierung, interkalieren. In Vorarbeiten von Clara Brieke wurde festgestellt, dass erstens nur PyBIPS, nach kovalenter Verknüpfung, noch vollständig photochemisch aktiv ist und zweitens eine Herstellung über Festphasensynthese nur in schlechter Ausbeute realisierbar ist. Ausgehend davon wurde PyBIPS an die drei nicht-nukleosidischen Linker, Aminoglykol, D-Threoninol und Serinol, postsynthetisch über eine Amidbindung angebracht, die zuvor über Oligonukleotidfestphasensynthese in 2´-OMe-RNA eingebaut wurden. In der photochemischen Charakterisierung konnte gezeigt werden, dass PyBIPS, gebunden an alle drei Motive, noch photochemisch aktiv ist und im Vergleich zu ungebundenem PyBIPS stabiler ist gegenüber Photolyse. In Untersuchungen im Doppelstrang im Wedge Motiv, d.h. im Gegenstrang befindet sich kein Nukleotid gegenüber dem Photoschalter, wurde ein ähnliches Verhalten festgestellt. Zusätzlich zur charakteristischen Merocyanin-Bande bei 550 nm ist ein zweites, rotverschobenes Absorptionsmaximum entstanden, das die gleichen Eigenschaften besitzt. In Schaltzyklen wurde festgestellt, dass eine Isomerisierung bis 660 nm möglich ist, was eine Anwendung im therapeutischen Fenster zwischen ca. 600 und 1000 nm von Blut ermöglichen würde. Das Auftreten der zweiten Bande hängt stark vom Linker und dem Baustein im gegenüberliegenden Strang ab. Es wird vermutet, dass sich das, sonst nicht-bevorzugte, TTT-Isomer der Merocyanin-Form, durch Stabilisierung durch die Umgebung im Oligonukleotid ausbildet. Zur Untersuchung, inwiefern die Isomerisierung des Photoschalters die Duplexstruktur beeinflusst, wurden Schmelzpunktstudien und Fluoreszenzmessungen zur KD-Bestimmung durchgeführt, ohne dass eine Veränderung zu erkennen war. In einer größeren NMR-Studie, in Kooperation mit Tom Landgraf (Arbeitsgruppe Prof. Dr. Harald Schwalbe) wurde der Fokus darauf-gelegt mehr Informationen über die strukturelle Integrität zu erhalten. Es findet eine Störung der benachbarten Basenpaarungen durch den Photoschalter statt, jedoch kann die Kraft der Isomerisierung des Photoschalters nicht übertragen warden. Der Einfluss war zunächst geringer als erwartet, was in anderen Anwendungen überprüft warden muss. Im zweiten Projekt steht das Membranprotein OmpG aus E. Coli K12 im Fokus. Proteine besitzen viele verschiedene funktionelle Gruppen, die für selektive Biokonjugation genutzt werden können in einer Reihe von Anwendungen. OmpG gehört zur Gruppe der Porine, die in der äußeren Membran von Gram-negativen Bakterien sitzen und die seltene ß-Fassstruktur ausbilden. Die Pore besitzt einen großen Innendurchmesser ohne Selektivität. Das Molekül wurde bereits intensiv auf seine Struktur, insbesondere Loop 6, der pH-abhängig die Pore verschließt, untersucht. In Vorarbeiten von Grosse et al. wurde der Loop entfernt, sodass ein ruhiger Kanal entstanden ist, der ein optimales Modellsystem darstellt. Außerdem wurden in der Pore zwei Cysteine, die auf gegenüberliegenden Seiten auf halber Höhe des Kanals sitzen, eingeführt. An die Thiolgruppen wurden photolabile Schutzgruppen angebracht, die erst den Kanal blockieren und nach Abspaltung durch Licht wieder freigeben. Dazu wurde jeweils ein 7-Diethylaminocumarin (DEACM) postsynthetisch angebracht. Der Linker am Cumarin-Alkohol stellt dabei einen Kompromiss dar, da er zum einen selektiv mit der Thiolgruppe des Cysteins reagieren soll, gleichzeitig aber noch photo-induziert wieder abspalten muss. Durch Belichtung findet eine Hydrolyse des Esters unter Abspaltung des Alkohols statt, der einen Carbonsäurerest am Thiol in der Pore zurück lässt. In spannungsabhängigen Einzelkanal-messungen, durchgeführt von Dr. Philipp Reiß (Universität Marburg), konnte gezeigt werden, dass die zwei DEACM Modifikationen eine Reduktion der Leitfähigkeit bewirkten und durch Licht abgespalten und aus dem Kanal entfernt werden konnten. Dabei war außerdem zu erkennen, dass die Leitfähigkeit aufgrund der Carboxylreste über das Niveau von unmodifiziertem OmpG steigt. ...
• Biological systems are under the control of mechanisms that are not completely decoded yet. In order to specifically control processes and regulate a system from the outside, an external trigger is necessary. One way of doing this, is to put the system under optical control, i.e. to implement light as an external tool of regulation and a chromophore as an internal modification. There are three main projects that will be presented in this thesis that are all based on that approach, but are executed in different ways. RNA plays a role in many different functions of the cell like protein synthesis or gene regulation. In the first project, the photoswitch spiropyran was used in the context of RNA. The major aim was to covalently attach the spiropyran PyBIPS to an oligonucleotide in order to regulate the hybridization of a duplex structure. Therefore, structural motifs for the post-synthetic labeling of RNA with the photoswitch were screened. The sterically demanding spiropyran-form was supposed to disturb the duplex structure, while the flat and conjugated merocyanin-form is supposed to stabilize the hybridization by intercalation in the base stack. In the preliminary results by Clara Brieke, PyBIPS turned out to be the only Spiropyran staying photochemically active post covalent attachment. Additionally, the implementation via oligonucleotide solid phase synthesis was only achieved in low yields. Following this, PyBIPS was attached to the three non-nucleosidic linker aminoglycol, D-threoninol and serinol via an amide-bond post-synthetically after integration of the linker by solid phase synthesis. In a photochemical characterization PyBIPS, bound to all three linkers, appeared to be photochemically active and was in comparison to the non-attached PyBIPS more stable against photobleaching. Investigation of the duplex structure in the wedge motif, i.e. there is no nucleotide on the opposite site of the photoswitch, revealed a similar behavior as in the single strand, except for the appearance of a second bathochromic absorption maximum of the merocyanin-form around 590 nm with the same properties. In the switching cycles it was demonstrated that an isomerization was possible by the usage of 660 nm light which enables an application in the therapeutic window of blood. The appearance of the new band is strongly dependent from the linker as well as the motif opposite to PyBIPS in the counter strand. A reason can be that the usually non-favored TTT-merocyanin-form is now stabilized by the environment in the oligonucleotide cavety. In order to quantify, how isomerizing the photoswitch actually affects the structure of the duplex, melting point studies and fluorescence studies for KD-determination were performed without any result. An NMR-study by Tom Landgraf (group of Prof. Dr. Harald Schwalbe) was supposed to reveal more information about the structural integrity, showing that PyBIPS disturbs the neighboring base pairs at all time. The energy of the isomerization was not sufficient to transfer it on the rigid duplex structure which did not meet the expectations and should be applied in other systems in the future. The focus of the second project was on the membrane protein OmpG from E. Coli K12. Proteins offer a number of different functional groups that qualify for selective bioconjugation in a number of applications. OmpG is a porin from the outer membrane of gram-negative bacteria and has a rare ß-barrel structure. The pore has a wide diameter and no selectivity at all. The macromolecule has been intensively investigated on its structure, especially loop 6 which closes the pore pH-dependently. In preliminary results, Grosse et al. removed loop 6 resulting in a quiet pore that serves as an excellent model system. Furthermore, two cysteine residues were installed at half height of the barrel on opposite sides. The thiol functional groups were then utilized for the installation of two photolabile protecting groups that were supposed to block the channel in the first place and be released by irradiation with light. 7-Diethylaminocoumarin (DEACM) was attached to both cysteines post-synthetically. The linker bound to DEACM is a compromize, as it has to react with the thiol moiety of cysteine selectivly and should still be able to cleave off photoinduced. DEACM-alcohol is released after irradiation and subsequent hydrolysis of the ester, leaving a carboxylic resin on the thiol in the pore behind. In voltage-dependent single molecule measurements (Dr. Philipp Reiß, Marburg University) it was demonstrated that the two DEACM modifications reduced conductivity. After irradiation and cleavage, the blockage was removed resulting in a higher conductivity. The new level above the native unmodified state of OmpG is due to the carboxylic groups left behind. ...