Open Access

Alexander Rittner

• Natural products are valuable sources for biologically active compounds, which can be utilized as pharmaceuticals. Thereby, the synthesis is based purely on biosynthetic grounds often conducted by so-called megaenzymes. One major biosynthetic pathway is the acetate pathway including polyketide and fatty acid synthesis, which encompass one of the largest classes of chemically diverse natural products. These have medicinal relevance due to their antibacterial, antifungal, anthelmintic, immunosuppressive and antitumor properties. Due to the high structural and functional similarity between polyketide synthases and type I animal fatty acid synthases (FASs), FAS can serve as a paradigm for the whole class of multifunctional enzymes. To fully exploit the biosynthetic potential of FASs, a good access to the enzyme is of essential importance. In this regard, Escherichia coli remains an unchallenged heterologous host due to low culturing costs, particularly fast mutagenesis cycles and relatively easy handling. Surprisingly, no sufficient expression strategy for an animal FAS in E. coli has yet been reported, as it turned out that the only approach was not reproducible. We commenced our analysis with searching for an appropriate FAS homolog that fulfills our requirements of high protein quality, sufficient yield and ensured functionality. After extensive screening of different variants, culturing conditions and co-expression strategies, we identified the murine FAS (mFAS) as our protein of choice. The established purification strategy using tags at both termini led to a reproducible and sufficient access to the protein in excellent quality. The enzyme was further biochemically characterized including an enzyme kinetic investigation of fatty acid synthesis and an examination whether different acyl-CoA substrates can serve as priming units. This adds mFAS to our repertoire of manageable megaenzymes paving the way to exploit the catalytic efficiency in regards of microbial custom-compound synthesis. With a strong focus on deepening our understanding of the working mode of such megaenzymes, rather than analyzing respective biosynthetic products, we have addressed the question whether mFAS itself can be engineered towards PKSs or whether properties of mFAS can be exploited to engineer PKSs. This approach was conducted on three levels of complexity from function of individual domains via organization of domains to form modules to the interplay of two modules in bimodular constructs. Fatty acid synthesis begins with the loading of acyl moieties onto the FAS, which is conducted by a domain called malonyl-/acetyltransferase (MAT). This domain was in-depth characterized due to its important role of choosing the substrates that are built in the final compound. Our analysis comprised structural and functional aspects providing crystal structures of two different acyl-bound states and kinetic parameters for the hydrolysis and transacylation reaction using twelve exemplary CoA-esters. For this purpose, we have successfully established a continuous fluorometric assay using the α-ketoglutarate dehydrogenase as a coupled enzyme, which converts the liberated coenzyme A into Nicotinamide adenine dinucleotide. These data revealed an extensive substrate ambiguity of the MAT domain, which had not been reported to that extent before. Further, we could demonstrate that the fold fulfills both criteria for the evolvability of an enzyme by expressing MAT in different structural arrangements (robustness) and by altering the substrate ambiguity within a mutagenesis study (plasticity). Taken these aspects together, we are persuaded that the MAT domain can serve as a versatile tool for PKSs engineering in potential FAS/PKS hybrid systems. On the higher level of complexity, we investigated the architectural variability of the mFAS fold, which constitutes a fundamental basis for a broader biosynthetic application. We could rebuild all four module types occurring in typical modular PKSs confirming a high degree of modularity within the fold. Not only structural, but also functional integrity of these modules was validated by using triacetic acid lactone formation and ketoreductase activity. Especially the latter analysis, made it possible to quantify effects of the engineering within the processing part by respective enzyme kinetic parameters. Expanding our focus beyond a singular module, we have utilized the mFAS fold for designing up to 380 kDa large bimodular constructs. In this approach, a loading didomain was attached N-terminally containing an additional MAT and acyl carrier protein (ACP) domain. Two constructs could be expressed and purified in excellent quality to investigate the influence of an altered overall architecture on fatty acid synthesis. By comparison with appropriate controls, a functional effect of the additional loading module could indeed be proven in the bimodular systems. Those constructs allow a comprehensive analysis of the underlying molecular mechanism in the future and serve as a potential model system to study the transition from iterative to vectorial polyketide synthesis in vitro.
• Naturstoffe sind wertvolle Quellen für biologisch aktive Verbindungen, die als Arzneimittel verwendet werden können. Dabei basiert die Produktion rein auf Biokatalyse, die oft von sogenannten Megaenzymen durchgeführt wird. Ein wichtiger biosynthetischer Weg ist der Acetatweg, der die Polyketid- und Fettsäuresynthese einschließt, und eine der größten Klassen chemisch unterschiedlicher Naturstoffe hervorbringt. Diese haben aufgrund ihrer antibakteriellen, antimykotischen, anthelmintischen, immunsuppressiven und antitumoralen Eigenschaften medizinische Relevanz. Aufgrund der hohen strukturellen und funktionellen Ähnlichkeit zwischen Polyketidsynthasen und Typ I Tierfettsäure-Synthasen (FASs) kann die FAS als Paradigma für die gesamte Klasse von multifunktionellen Enzymen dienen. Um das biosynthetische Potential von FASs voll ausschöpfen zu können, ist ein guter Zugang zum Enzym von wesentlicher Bedeutung. In dieser Hinsicht bleibt Escherichia coli ein unangefochtener heterologer Wirt aufgrund niedriger Kulturkosten, schneller Mutagenesezyklen und relativ einfacher Handhabung. Überraschenderweise wurde noch keine effiziente Expressionsstrategie für eine Tier-FAS in E. coli berichtet, da sich herausgestellt hat, dass die einzige, publizierte Strategie nicht reproduzierbar ist. Wir begannen unsere Analyse mit der Suche nach einem geeigneten FAS-Homolog, das unsere Anforderungen an hohe Proteinqualität, ausreichende Ausbeute und garantierte Funktionalität erfüllt. Nach einem umfangreichen Screening verschiedener Varianten, Kultivierungsbedingungen und Koexpressionsstrategien identifizierten wir die murine FAS (mFAS) als unser Protein der Wahl. Unsere etablierte Aufreinigungsstrategie, die auf der Verwendung von kurzen künstlichen Peptidsequenzen an beiden Termini basiert, gewährleistete einen reproduzierbaren und ausreichenden Zugang zum Protein in ausgezeichneter Qualität. Das Enzym wurde weiter biochemisch charakterisiert, einschließlich einer enzymkinetischen Analyse der Fettsäuresynthese und einer Untersuchung, ob verschiedene Acyl-CoA Substrate als Startermoleküle fungieren können. Damit wurde unser Repertoire von handhabbaren Megaenzymen um die mFAS erweitert, was den Weg zu einer Nutzung der katalytischen Effizienz in Bezug auf mikrobielle Synthese von maßgeschneiderten Verbindungen ebnet. Mit dem Fokus, das Verständnis für die Funktionsweise solcher Megaenzyme zu vertiefen, anstatt entsprechende Biosyntheseprodukte zu analysieren, haben wir uns mit der Frage beschäftigt, ob mFAS selbst in eine PKSs umgewandelt werden kann oder ob Eigenschaften von mFAS für die Entwicklung von PKSs genutzt werden können. Dieser Ansatz wurde auf drei Komplexitätsebenen von der Funktion einzelner Domänen über die Organisation von Domänen zu Modulen bis hin zum Zusammenspiel zweier Module in bimodularen Konstrukten durchgeführt. Die Fettsäuresynthese beginnt mit der Beladung der FAS mit Acyleinheiten, die von einer Domäne namens Malonyl-/Acetyltransferase (MAT) durchgeführt wird. Diese Domäne wurde aufgrund ihrer wichtigen Rolle bei der Auswahl der Substrate, die das Kohlenstoffgerüst des finalen Produktes mitbestimmen, detailiert charakterisiert. Unsere Analyse umfasste strukturelle und funktionelle Aspekte, wie z. B. das Lösen von Kristallstrukturen in zwei unterschiedlichen Acyl-gebundenen Zuständen und eine enzymkinetische Beschreibung der Hydrolyse- und Transacylierungsreaktionen für zwölf exemplarische CoA-Ester. Zu diesem Zweck wurde ein kontinuierlicher fluorometrischer Assay etabliert, der unter Verwendung der α-Ketoglutaratdehydrogenase als ein gekoppeltes Enzym freies Coenzym A in Nicotinamidadenindinukleotid umwandelt. Diese Daten enthüllten eine ausgedehnte Substratambiguität der MAT-Domäne, die zuvor nicht in diesem Ausmaß beschrieben worden war. Weiterhin konnten wir durch Expression der Domäne in verschiedenen strukturellen Anordnungen (Robustheit) und durch Veränderung der Substratspezifität innerhalb einer Mutagenesestudie (Plastizität) zeigen, dass MAT beide Kriterien für Proteinevolvabilität erfüllt. Daher sind wir davon überzeugt, dass diese Domäne als ein vielseitiges Werkzeug für PKS-Engineering in potenziellen FAS/PKS Hybridsystemen eingesetzt werden kann. Auf der höheren Komplexitätsebene untersuchten wir die architektonische Variabilität der mFAS-Faltungseinheit, was eine fundamentale Basis für eine breitere biosynthetische Anwendung darstellt. Wir konnten alle vier Modultypen rekonstruieren, die in typischen modularen PKSs auftreten, was einen hohen Grad an Modularität innerhalb der Faltungseinheit bestätigt. Nicht nur die strukturelle, sondern auch die funktionelle Integrität dieser Module wurde unter Verwendung der Triacetsäurelactonbildung und der Ketoreduktaseaktivität validiert. Insbesondere letztere Analyse ermöglichte es, Effekte des Engineerings innerhalb des prozessierenden Teils durch entsprechende enzymkinetische Parameter zu quantifizieren. Danach haben wir unseren Fokus über ein einzelnes Modul hinaus erweitert und die mFAS-Faltungseinheit zur Konstruktion von bis zu 380 kDa großen bimodularen Konstrukten verwendet. Bei diesem Ansatz wurde eine N-terminale Ladedidomäne angehängt, die eine zusätzliche MAT- und Acyl-Carrier-Protein-Domäne enthielt. Zwei Konstrukte konnten in exzellenter Qualität exprimiert und gereinigt werden, mit deren Hilfe der Einfluss einer veränderten Gesamtarchitektur auf die Fettsäuresynthese untersucht wurde. Durch einen Vergleich mit entsprechenden Kontrollen konnte in der Tat ein funktioneller Effekt des zusätzlichen Lademoduls nachgewiesen werden. Diese Konstrukte erlauben in der Zukunft eine umfassende Analyse des zugrunde liegenden molekularen Mechanismus und dienen daher als potentielles Modellsystem zur Untersuchung des Übergangs von einer iterativen zu einer vektoriellen Polyketidsynthese in vitro.