Open Access

Daniela Stadel

• Tectonin β-propeller containing protein 2 (TECPR2) was first identified in a mass- spectrometric approach as an interactor of GABARAP, an ATG8-family protein playing a role in autophagy. The mammalian ATG8 protein family consists of seven members, namely MAP1LC3A (LC3A), MAP1LC3B (LC3B), MAP1LC3C (LC3C), GABARAP, GABARAPL1 and GABARAPL2. All share an ubiquitin-like core and possess two additional N-terminal α-helices, which are important for the distinct functions of the proteins. First determined in various organelles the ATG8 proteins are shown to be involved in autophagy, supporting the formation and cargo recruitment of autophagosomes, the vesicles transporting cargo for autophagic degradation. Autophagy is the process of recycling cytoplasmic contents by degradation of misfolded proteins or damaged organelles in order to supply nutrients. Also clearance of pathogens can be achieved via autophagy. Importantly, LC3B is incorporated into the autophagosomal membrane and is therefore used as the main marker for autophagosomes. Previous studies exhibited that depletion of TECPR2 leads to a loss of LC3B-positive structures in cells, which suggests TECPR2 to positively regulate autophagic processes. A frame shift deletion in the gene encoding for TECPR2 causes the generation of a premature stop codon and subsequent an unstable version of the protein, which is then degraded. Mutation in the TECPR2 gene triggers a neurodegenerative disorder termed hereditary spastic paraparesis (HSP). HSPs are a diverse group of neurodegenerative diseases that are characterized by spasticity in prevalent lower extremities and were mediated by a loss of axonal integrity of the corticospinal motor neurons. In the context of HSP more than 50 gene loci were identified by now. While TECPR2 is a human ATG8 binding protein and positive regulator of autophagy causing a form of HSP, the exact function of TECPR2 is unknown. This study primarily focused on the determination of TECPR2’s binding mode to ATG8 proteins in vitro and in cells. The association of TECPR2 to all ATG8-family proteins was confirmed in in vitro pulldown experiments. Following fragment-based binding and peptide array experiments, the LC3-interacting region (LIR) of TECPR2 could be verified with mutants of TECPR2 lacking the LIR motif. Nuclear magnetic resonance (NMR) and isothermal titration calorimetry (ITC) were conducted to gain deeper insights into the binding preference to the different ATG8-family members. Moreover, the crystal structure of TECPR2-LIR was solved. In cells colocalization studies with overexpressed ATG8 proteins unraveled a preferential binding to the LC3-subfamily. Further, mass spectrometric analysis revealed novel association partners of TECPR2: SEC24D, HOPS and BLOC-1, all of those participating in different endomembrane trafficking pathways. Interaction and colocalization of TECPR2 with these components was validated with several immunoprecipitation experiments and the N-terminal part of the protein comprising the WD40-domain could be defined as the binding site for all three of the association partners. In further approaches, the requirement of the LIR-motif and the necessity of the availability of LC3 protein for the particular interactions were determined. Interestingly, in the absence of LC3C the binding of TECPR2 to SEC24D was completely disrupted whereas a loss of LC3B only resulted in a decreased association. Notably, the binding proteins were not subjected to autophagosomal degradation, indicating that TECPR2 may operate as a multifunctional scaffold protein. While depletion of TECPR2 destabilized HOPS and BLOC-1, the autophagy defect observed in TECRP2-deficient cells could not be attributed to functional impairment of these two complexes. Moreover, loss of TECPR2 led to a decline in protein levels of SEC24D and of its heterodimer partner SEC23A. Thus, TECPR2 is required to regulate the protein levels of SEC23A and SEC24D and subsequently the formation of the heterodimers. Together, SEC24D and SEC23A form the inner coat of COPII vesicles. These vesicles are responsible for the anterograde transport of cargo from the ER toward the Golgi compartment. COPII-coated vesicles are secreted form ER at distinct sites, termed ER exit sites (ERES). The small GTPase SAR1A maintains the vesicle budding, coating and secretion at the ERES. Together with SEC13, SEC31 forms the outer coat of the COPII vesicles and therefore serves as a general ERES marker. Consistent with a defect in COPII coat assembly, the number of ERES diminished in the absence of TECPR2. These phenotypes could be rescued by the wildtype TECPR2 protein but not by the LIR-mutant. Intriguingly, these results were mimicked by depletion of LC3C, which localized to ERES. By monitoring the release of various cargos from ER in dependency of TECPR2 or LC3C, a role of both proteins in ER export was determined. These facts indicated that TECPR2 cooperates with LC3C to facilitate COPII assembly, ERES maintenance and ER export. Notably, fibroblast derived from a HSP patient carrying mutated TECPR2 showed diminished SEC24D protein levels and delayed ER export. Concurrent with emerging evidence for a role of ERES in autophagosome formation, depletion of TECPR2 or LC3C or overexpression of a constitutive inactive SAR1 mutant reduced puncta formation of the early autophagosomal protein WIPI2. In summary, this study uncovered a role for TECPR2 in ER export at ERES through interaction and stabilization of SEC24D, a COPII coat protein. This process also depended on ATG8-family protein LC3C, which is localized at ERES. Both proteins are required for correct COPII-mediated secretion. Moreover, the presence of TECPR2 and LC3C on ER allows development of omegasomes, membranous structures budding ER to form autophagosomes, by stabilization of WIPI2 and therefore contribute to autophagosome formation.
• TECPR2 wurde zunächst in einer massenspektrometrischen Analyse der ATG8-Proteine als Interaktionspartner von GABARAP identifiziert. In Säugetieren sind sechs verschiedene ATG8-Proteine zu finden: MAP1LC3A (LC3A), MAP1LC3B (LC3B), MAP1LC3C (LC3C), GABARAP, GABARAPL1 und GABARAPL2. Sie werden in eine LC3- und eine GABARAP-Unterfamilie eingeteilt, welche beide am Prozess der Autophagie beteiligt sind. Dies ist ein Qualitätskontroll- und Recyclingprozess von zytoplasmatischen Bestandteilen wie beispielsweise fehlgefalteten Proteinen oder beschädigten Organellen mit dem Ziel die Zelle vor Schädigungen zu schützen und Nährstoffe bzw. Bausteine für neue Komponenten bereitzustellen. LC3B ist von großer Bedeutung, da es von der Ausbildungsphase bis zum fertigen Autophagosom in dessen Membran integriert bleibt und somit als genereller Marker für Autophagosomen genutzt werden kann. Eine Basenpaarverschiebung im TECPR2 Gen führte zu Erzeugung eines verfrühten Stopcodons und somit zum proteasomalen Abbau des Proteins. Mutationen im TECPR2 Gen lösen eine Gruppe von neurodegenerativen Erkrankung, die hereditären spastischen Paraparesen (HSPs), aus. Diese zeichnen sich durch spastische Lähmungen der unteren Extremitäten aus und zu deren Entstehung tragen über 50 Genloci und 20 Genprodukte bei. Zudem wurde gezeigt, dass das Fehlen von TECPR2 in Zellen zu einem Verlust von LC3B-positiven Strukturen, also Autophagosomen führt. Obwohl ein Zusammenhang von TECPR2 zu dem Krankheitsbild der HSP und Autophagie hergestellt werden konnte, blieb die exakte Funktion des Proteins in Zellen weiterhin ungeklärt. Zunächst beschäftigte sich diese Arbeit mit der Bestätigung der Bindung von TECPR2 zu den ATG8-Proteinen in vitro und in Zellen. Mithilfe von TECPR2-Fragmenten konnte in Pulldown-Assays und Peptid Arrays ein LC3-interagierendes Motiv (LIR) am Ende des C-terminus festgesetzt werden. In biophysikalischen Versuchsreihen wie der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) und der Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) sollte die Interaktion zwischen TECPR2 und den ATG8-Proteinen genauer untersucht werden, um eventuelle Bindepräferenzen zu bestimmten ATG8-Untergruppen zu detektieren. Darüber hinaus wurde die Kristallstruktur des LIR-Motives von TECPR2 analysiert. Schließlich wurde bei Kolokalisationsexperimenten mit endogenem TECPR2 in Zellen eine Bindepräferenz zu LC3B und LC3C deutlich. In massenspektrometrischen Analysen konnten TECPR2 folgende neuen Interaktionspartner zugeordnet werden: SEC24D, HOPS und BLOC-1, welche alle endomembran-abhängigen Transportwegen in Zellen zuzuordnen sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Interaktion zu den genannten Proteinen und Komplexen validiert und in allen drei Fällen der N-terminale Teil von TECPR2, der die WD40-Domäne beinhaltet, als Binderegion ausgemacht. Darüber hinaus wurde als Vorraussetzung der Interaktion die Bindung von TECPR2 an LC3 mittels des LIR-Motives enthüllt. Interessanterweise zeigte bei der Interaktion von TECPR2 zu SEC24D die Beteiligung von LC3C den größten Einfluss. Nennenswert ist auch, dass die Interaktion mt TECPR2 nicht zur Degradierung der Proteine mittels Autophagie führte. Weiterhin wurden die Komplexe HOPS und BLOC-1 in Abwesenheit von TECPR2 instabil und proteasomal abgebaut. Somit trägt TECPR2 zu deren Integrität in Zellen und damit auch zur korrekten Funktion der Komplexe bei. Allerdings konnte kein Zusammenhang zu dem von TECPR2 ausgelösten Defekt in der Autophagie herstellt werden. Im Falle von SEC24D, führte das Fehlen von TECPR2 zu einer Destabilisierung von SEC24D und dessen proteasomalem Abbau, sowie dem Abbau seines Heterodimerpartners SEC23A. Somit reguliert TECPR2 die Levels der beiden Proteine und in der Folge deren Heterodimerisierung. Zusammen bilden SEC24D und SEC23A die innere Hülle von COPII-Vesikeln, welche für den anterograden Transport von Cargo vom ER in Richtung Golgi Apparat zuständig sind. Die Vesikel werden vom ER an speziellen Stellen, den ER-Austrittstellen (ERES), abgespalten und entlang des Seketionsweges in die verschiedenen Kompartimente verteilt. Die kleine GTPAse SAR1A unterstützt das Abspalten, die Hüllbildung und Sekretion an den ERES. Dabei bilden SEC13 und SEC31 die äußere Hülle der COPII-Vesikel und werden daher als ERES Marker verwendet. Durch den Verlust von TECPR2 in Zellen kam es zu einer Reduktion von ERES und COPII-Vesikeln und somit zu einem generellen Defekt des Sekretionsweges. Brachte man TECPR2 zurück in die Zellen, konnte der Phänotyp nur mit dem Wildtyp des Proteins nicht aber mit der LIR-Mutante umgekehrt werden. In diesem Versuchsaufbau wurden mit LC3C dieselben Effekte erzielt. Die Rolle von TECPR2 und LC3C am korrekten Ablauf der ER-Sekretion wurde mithilfe verschiedener Cargoproteinen und deren Austrittsverhalten aus dem ER demonstriert. Zudem zeigte das ER eine Veränderung seiner Morphologie und eine generelle Volumenzunahme. Dabei besonders erwähnenswert ist, dass Fibroblasten von HSP-Patienten, die eine TECPR2-Mutation tragen, ebenfalls reduzierte SEC24D Proteinlevel zeigten und zudem der Export von Cargo aus dem ER dieser Zellen verzögert war. Gleichzeitig führten das Fehlen von TECPR2 oder LC3C sowie die Überexpression einer dominant-negativen Mutante von SAR1A zu einer Reduktion des frühen Autophagiemarkers WIPI2, welches an Omegasomen, frühen autophagischen Membranstrukturen am ER, lokalisierte. Zusammenfassend demonstriert diese Studie eine Beteiligung von TECPR2 am Cargo-Export aus dem ER an den ERES durch Interaktion und Stabilisation von SEC24D, in Abhängigkeit von LC3C. Beide Proteine zusammen erlauben die korrekte Sekretion von spezifischem Cargo der COPII-Vesikel und sind durch die Stablisierung von WIPI2, am Aufbau von Omegasomen am ER beteiligt, was somit die Bildung von Autophagosomen unterstützt.