Open Access

Christopher Hein

• Small molecule drug discovery is strongly supported by biophysical data. In the reach of this thesis, cell free protein expression was used to produce human target proteins for ligand binding assays using Surface Plasmon Resonance spectroscopy (SPR). In the second step the binding and interaction characteristics of small molecules and fragments were analyzed using Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (NMR). The first target protein was the human acid sensing channel 1 (ASIC1a). ASIC1a was expressed in a cell free expression system based on E.coli lysate. To optimize the expression, several parameters including fusion tags, ion concentrations and different hydrophobic environments were tested. The adaption of the folding environment for ASIC1a needed more optimization, because it is a very challenging target to express in an in vitro system. Three different expression modes were employed to find a suitable folding environment. SPR binding studies with ASIC1a were performed with chicken ASIC1a expressed in insect cells. The immobilization of cASIC1a and the used buffer conditions were tested using Psalmotoxin 1, a naturally occurring peptide venom which binds strong to the trimeric form of ASIC1a. Compound characterization experiments were performed with a variety of different ligands including amiloride, a general blocker of the whole ENaC protein family. None of the used ligands showed titration curves that would match a simple 1:1 binding model. The experiments either show no binding signal or signal that could be interpreted as unspecific binding. Even amiloride that should be binding the protein shows no signals that fit a simple binding model. Another target protein that was investigated is the soluble prolyl cis/trans isomerase Cyclophilin D (or peptidyl prolyl isomerase F – PPIF). This protein is involved in the regulation of the mitochondrial permeability transition pore and therefore a potential drug target to treat neurodegenerative diseases. Small molecule binding was tested with CypD using SPR. Following the kinetic analysis of small molecule ligands, the binding position of different binding fragments was analyzed. These fragments originated from a SPR based fragment screen and gave no co-crystal structures with CypD. Therefore NMR was used to investigate the binding position of these fragments. An analysis of the chemical shift perturbations upon ligand addition revealed that the NMR analysis was in line with the results gathered by x-ray crystallography. The fragments with unknown binding position however, all bind to a specific patch slightly outside the binding pocket. The ligand CL1 showed a special behavior in the NMR experiments. Upon addition to CypD, it produced large shifts on many signals of the protein, accompanied by a severe line broadening. The shift perturbations were so numerous and large that the spectrum had to be reassigned in complex with the ligand. Triple selective labeling was applied to allow a fast and nearly complete signal assignment. The possibility to use highly sophisticated labeling schemes, is one of the advantages of cell free protein expression. After the assignment of the complex spectrum, the chemical shift perturbations were analyzed and quantified. The residues showing the strongest CSPs are also identified in the crystal structure to be involved in the binding of CL1, giving a consistent picture. The numerous and large shift perturbations, produced by CL1 led to the assumption, that the ligand induces a conformational change in CypD, which is not represented in the co-crystal structure. This conformational change was characterized by a NMR based structure determination. CypD apo yielded a defined bundle, whose folded regions overlap well with the corresponding crystal structure. For the calculation of the CypD-CL1 complex structure, the sidechain resonances were assigned using an automated assignment approach with the software FLYA. The calculation of the CypD-CL1 complex structure did not result in a defined bundle. While parts of the protein converge in a well folded state, the region around the active site shows no defined folding. Careful analysis of the structure calculation suggests that the problems during structure calculation did not originate from an incorrect resonance assignment, but rather from a lack of NOE crosspeaks. This might be due to a broadening of the corresponding NOE crosspeaks or the coexistence of many different conformations. This leads to the conclusion, that the protein conformation is not defined by the NMR data and could be in a dynamic interchange between multiple structures. This hypothesis is supported by other observations. The line broadening of the signals in the complex is pronounced in the area around the active site and the substrate binding pocket, hinting to a connection between catalytic activity and protein dynamics. In addition many NMR signals are sensitive to changes in the measurement field strength and the temperature. This field dependent signal splitting suggests dynamic conformational changes in the protein between at least two different conformations on a millisecond timescale. The current working model is that CL1 binds to CypD and induces the catalytic cycle and the connected conformational changes in CypD. As a result the proline like moiety in CL1 is constantly switching between the cis and the trans conformation. Due to the high affinity of CL1, the inhibitor does not leave the binding pocket after successful catalysis, but stays bound in the pocket stimulating further catalytic cycles. These findings as well as the working model are well in line with data published for Cyclophilin A, another member of the cyclophilin family, thereby supporting the model.
• Die Entwicklung und Optimierung von kleinen organischen Molekülen zu medizinischen Wirkstoffen ist ein langer und aufwendiger Prozess. Biophysikalische Daten zu Bindungsort und Bindungskinetik sind eine wichtige Grundlage dieser Optimierung. Das Ziel dieser Arbeit war die zellfreie Expression medizinisch relevanter Zielproteine sowie die detaillierte Analyse potenzieller niedermolekularer Inhibitoren. Hierbei lag ein Augenmerk auf der zellfreien Protein Produktion, da diese einige Vorteile für etwaige spätere Anwendungen bietet. Es wurden das Membranprotein ASIC1 (acid sensing channel 1), sowie die Prolyl cis/trans isomerase CypD (Cyclophilin D) untersucht. Die zellfreie Expression von ASIC1 wurde in einem System auf Basis eines E.coli Zelllysats opimiert. Die ersten Schritte beinhalteten die Optimierung des Expressionskonstrukts, sowie der verwendeten Ionenkonzentrationen. Nach einer Optimierung der Ionenkonzentrationen während der Expression wurde die Faltungsumgebung im System optimiert. ASIC1a stellt hierbei große Anforderungen an das System, da es sowohl eine große lösliche Domäne als auch eine Transmembrandomäne enthält, die sehr unterschiedliche Milieus für eine korrekte Faltung benötigen. Es wurden neben Detergenzien auch Nanodiscs in die Optimierung mit eingeschlossen, da diese viele Vorteile von Detergenzien und Lipiden verbinden. Die Qualitätsprüfung des zellfrei produzierten ASIC1a konnte jedoch aufgrund des Fehlens einer aktiven Positivkontrolle nicht etabliert werden. An diesem Punkt des Projekts lieferte die Firma Proteros ASIC1a, das in Insektenzellen produziert und aus diesen gereinigt wurde. Dieses Protein wurde verwendet, um SPR Studien durchzuführen und die Bindung einiger Liganden zu untersuchen. Mithilfe des natürlich vorkommenden Peptidtoxins Psalmotoxin1 (PcTx1) wurde die die Proteinqualität und die gewählte Immobilisierungsmethode getestet. Da die erhaltenen Daten im Einklang mit publizierten Daten stehen, wurde die Analyse auf weitere Liganden ausgeweitet. Unter Anderem wurde Amilorid als Positivkontrolle verwendet, da dieses ein genereller Inhibitor für die die gesamte ENaC Familie ist. Trotz Optimierung einiger Versuchsparameter wie pH Wert und verwendete hydrophobe Umgebung konnte für keines der getesteten kleinen Moleküle eine Messung durchgeführt werden, die auf eine spezifische Protein-Liganden Interaktion schließen lässt, welche einem einfachen 1:1 Bindungsmodell folgt. Die Ergebnisse zeigen entweder nur Hintergrundsignale, sehr kleine negative Signale oder Signale die auf unspezifische Bindung hinweisen. Auch eine Analyse von Amilorid, welches binden sollte, hat keine klaren Ergebnisse geliefert. Der zweite Teil der Arbeit hat sich mit der Prolyl cis/trans isomerase Cyclophilin D beschäftigt. CypD ist ein zentraler regulatorischer Faktor der "mitochondrial permeability transition pore" und somit ein potenzieller Angriffspunkt für Medikamente zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen. Neben verschiedenen kleinen Molekülen mit verschiedenen Bindungskinetiken, wurde auch der natürlich vorkommende und hochaffine Ligand Cyclosporin A mittels SPR charakterisiert. Für die Entwicklung eines potenten Inhibitors ist es notwendig sowohl Informationen über die Bindungskinetik als auch strukturelle Informationen über den Bindungsort zu erhalten. Standardmäßig wird hierfür Röntgenkristallographie verwendet. Da die meisten Fragmente jedoch keine Ligand-Protein Kristalle lieferten, wurde NMR verwendet um die benötigten Informationen zu ermitteln. Mittels NMR wurde die Bindung einiger Fragmente bestätigt und deren Bindungsort bestimmt. Für die Fragmente mit unbekanntem Bindungsort, zeigten die Messungen, dass alle an einer sehr ähnlichen Position in der Nähe der Substratbindetasche binden. Die Untersuchung des Liganden CL1 zeigte während der NMR Analyse allerdings einige unerwartete Effekte. Die Bindung von CL1 induziert eine Signalverschiebung von sehr vielen CypD Signalen, die mit einer starken Signalverbreiterung der Signale einhergeht. Aufgrund der Signalverbreiterung wurde ein spezielles Schema zur selektiven Markierung von CypD verwendet, das gekoppelt mit ausgewählten Experimenten eine nahezu vollständige Zuordnung der N und HN Resonanzen ermöglichte. Die starke Signalverschiebung durch die Ligandenbindung führte zu der Hypothese, dass die Bindung von CL1 an CypD zu einer Konformationsänderung des Proteins führt. Der Versuch diese Änderung durch eine NMR basierte Strukturrechnung zu untersuchen zeigte, dass es sich nicht um eine statische Konformationsänderung handelte, sondern um eine Veränderung der Proteindynamik. Während die Resonanzen für die Strukturrechnung von CypD apo noch manuell zugeordnet wurden, wurde für den CypD-CL1 Komplex eine automatische Signalzuordnung verwendet, die jedoch auf der Basis einer Reihe manuell zugeordneter Signale durchgeführt wurde. Im Gegensatz zu CypD apo konvergierte die CypD-CL1 Strukturrechnung nicht zu einer Struktur, da im Bereich um die aktive Seite kaum NOE Signale vorhanden waren. Der Bereich um die Substratbindetasche und das aktive Zentrum des Proteins zeigt die stärkste Signalverbreiterung nach CL1 Bindung. NMR Messungen bei unterschiedlichen Feldstärken und Temperaturen geben Hinweise darauf, dass es sich um eine dynamische Konformationsänderung der Reste in der Substratbindetasche handelt, die von CL1 induziert wird. Dies führte zu dem Modell, dass CL1, welches einen Prolin ähnlichen Teil enthält, den katalytischen Zyklus von CypD stimuliert. Das Protein oszilliert dadurch konstant zwischen mindestens zwei Konformationen.