Efficient gene silencing in tumor tissue using replication-competent retroviral vectors

  • Durch RNAinterferenz (RNAi) läßt sich die Expression eines beliebigen Gens spezifisch unterdrücken. Dafür müssen in das Zytoplasma kurze, doppelsträngige RNA Moleküle (siRNA bzw. shRNA) eingebracht werden, die teilweise komplementäre Sequenzen zu dem Zielgen aufweisen. Um siRNAs mit einer hohen Effizienz und Kopienzahl in die Zielzelle einzubringen, wurden Transfersysteme unterschiedlicher Art entwickelt. Nicht-virale Transfersysteme können nur einen transienten Effekt auslösen - ein Umstand, der für Langzeitstudien eine mehrfache Transfektion bedingt. Zur Lösung dieses Problems wurden retrovirale Vektorsysteme entwickelt, die durch Integration der shRNA-Expressionskassette in das zelluläre Genom eine stabile Unterdrückung eines Zielgens erreichen können. Insbesondere für präklinische Studien in vivo ist jedoch ein System mit erhöhter Transferrate wünschenswert, um in möglichst vielen Zielzellen einen RNAi-Effekt zu bewirken. Sliva et al. konnten zeigen, dass das Murine Leukämie Virus (MLV) theoretisch diese Anforderung erfüllt. Dafür wurde eine shRNA-Expressionskassette in das Virusgenom eingefügt und in vitro ein RNAi-Effekt nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde dieses System nun durch die Verwendung von microRNA-adaptierten shRNAs (shRNAmir) verbessert. In mehreren Publikationen wurde bestätigt, dass shRNAs, die endogenen microRNAs nachempfunden sind, eine höhere Effizienz und niedrigere Toxizität aufweisen. Zunächst wurde die für die genetische Stabilität optimale Orientierung der shRNAmir-Expressionskassette bestimmt. Das Konstrukt in reverser Orientierung wies eine Deletion in der shRNAmir Promotersequenz auf, die wahrscheinlich durch Interferenz mit dem 5’LTR Promoter entstanden ist. Mit dem genetisch stabilen Viruskonstrukt wurden Experimente zur Reduktion der Expression von Markergenen durchgeführt, um die Effizienz der RNAi-Aktivität leicht zu quantifizieren. Dafür wurden humane Fibrosarkom (HT1080) Zellen infiziert, die eGFP oder Luziferase stabil exprimieren. Mit eGFP- und Luziferase-spezifischen shRNAmir-Expressionskassetten konnte nach Infektion eine Herunterregulation von eGFP auf etwa 20 % und für Luziferase auf unter 10% beobachtet werden. Das Kontrollvirus, das eine unspezifische shRNAmir kodiert, hatte keinen Einfluss auf die Expression beider Markerproteine. Die Kinetik mit der die Markerproteine herrunterreguliert wurden, war abhängig von der Virusdosis. Die Virusdosis hatte aber keinen Einfluß auf die Stärke des RNAi-Effekts, der nach Infektion aller Zellen festgestellt werden konnte. Dieses Ergebnis entspricht der Erwartung an ein replikatives Transfersystems, das je nach applizierter Virusdosis unterschiedlich schnell RNAi in der Zellkultur ausbreitet und induziert. Die Anwendbarkeit dieses RNAi-Transfersystems auch für endogene Gene wurde mit MMP14-spezifischen shRNAmirs gezeigt. Nach Infektion von HT1080 Zellen mit den entsprechenden Viren in HT1080 Zellen konnte eine verringerte Menge an MMP14 mRNA und Protein nachgewiesen werden. Dies konnte funktionell durch eine verringerte Menge an intermediärem MMP2 und durch eine reduzierte Invasivität bestätigt werden. Zudem war die Fähigkeit dieser Zellen subkutane Tumore zu bilden stark eingeschränkt. Um die Anwendbarkeit dieses Systems für in vivo Applikationen zu zeigen, wurde in Mäuse, die Luziferase-exprimierenden Tumoren trugen, MLV-shLuc oder das Kontrollvirus systemisch appliziert. 21 Tage nach Virusgabe konnte in den Tumoren von MLV-shLuc infizierten Mäusen eine Abnahme der Luziferaseaktivität auf 15 % nachgewiesen werden. Auch in Mäusen, die systemisch applizierte Tumorzellen erhielten, konnte eine Tendenz von RNAi-vermittelter Luziferase-Reduktion beobachtet werden. Damit wurde in dieser Arbeit ein neuartiges RNAi-Transfersystem geschaffen, das in der Lage ist, auch in vivo einen starken und lang andauernden RNAi-Effekt auszulösen. Die Einzigartigkeit besteht in der Kombination von shRNAmir und Replikations-kompetenten Retroviren. Dadurch konnte eine erweiterte Transferrate von shRNAmir in Tumorzellen erreicht werden, so dass nun Genfunktionsstudien mit sehr hoher Aussagekraft möglich sind.
  • RNA interference (RNAi) has become a powerful technology in cancer and biomedical drug research. While the mechanism of RNAi activity is well understood, particularly the in vivo delivery still remains a matter of improvement. Non-viral transfer systems mediate only transient activity which requires multiple transfections for long-term observations. Therefore, viral vector systems were developed that confer stable integration of shRNA into the cellular genome. Especially for preclinical studies in vivo, a RNAi transfer system is preferred that efficiently distributes RNAi to all target cells (e.g. tumor cells) upon systemic application. However, current viral vectors are replication-deficient which limits their use in vivo. It was hypothesized that long term suppression and efficient delivery can be combined when replication-competent retroviral vectors are used as delivery vehicle. Previously, it was shown in vitro that the murine leukemia virus (MLV) accepts the insertion of shRNA expression cassettes. This system was further developed in the present thesis to a second generation system by flanking the shRNA with sequences derived from an endogenous microRNA (miR30). shRNAs designed to mimick endogenous RNA triggers perturbe the host cell to a lower extent and are more potent in their silencing activity than conventional shRNAs. Initial studies on the orientation of the shRNAmir expression cassette in the virus genome revealed that one orientation (5’-3’) showed genetic stability, but for the other orientation a deletion in the promoter sequence was observed. The activity of the 5’-3’ virus construct was monitored by silencing marker genes on the fibrosarcoma cell line HT1080 which stably expressed either eGFP or luciferase. Using marker gene-specific MLV-shRNAmir, eGFP was suppressed by MLV-shGFP to 20% compared to control virus whereas luciferase silencing was more efficient with a reduction to less than 10% by MLV-shLuc. Remarkably, silencing kinetics were dependent on the virus dose used for infection. Moreover, when all cells were successfully infected, the maximum extent of gene silencing was achieved irrespective of the virus dose applied. In contrast, control virus with an unspecific shRNAmir had no influence on marker gene expression. The potential of this system for cancer research was demonstrated by using a MMP14-specific shRNAmir virus construct (MLV-shMMP14). MMP14 is known to contribute to tumor growth and to the formation of metastasis through, for example, proteolytic cleavage of proMMP2 to its active form. Active MMP2 is a tumor specific protease capable of efficiently degrading components of the extracellular matrix. In MLV-shMMP14-infected cells, MMP14 was suppressed on mRNA as well as on protein level shown by qRT-PCR and western blotting. As a consequence, proMMP2 activation and invasion activity were reduced in vitro. In vivo, subcutaneous tumor growth of preinfected cells in SCID mice was decreased to 30%. To demonstrate sufficient RNAi delivery after systemic application, MLV-shLuc was intravenously injected into SCID mice bearing subcutaneous, luciferase expressing HT1080 tumors (HT1080-Luc). Robust in vivo actvity was shown 20 days after virus injection, when luciferase expression in tumor tissue was suppressed to 17% compared to control virus infected animals. Furthermore, to show activity also for disseminated tumor tissue a metastasis model with HT1080-Luc was successfully established. There was a clear tendency of MLV-shLuc mediated suppression as seen with non-invasive bioluminescent in vivo imaging. Hence, a second generation RNAi transfer system was successfully established which is based on replication-competent retroviral vectors. This system supports long-term suppression, strong silencing activity and extented delivery to tumor cells in vitro and in vivo. This combination of features is unique in the field of RNAi transfer systems allowing gene function studies of tumor biology in an unprecedented way.

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Metadaten
Author:Thomas Schaser
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-333369
Referee:Rolf MarschalekORCiDGND, Christian J. Buchholz
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2014/03/19
Year of first Publication:2013
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2013/04/10
Release Date:2014/03/19
Page Number:122 S.
Note:
Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS-PPN:364925647
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
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