Tissue Engineering - Kultivierung verschiedener Progenitorzellen mit mesenchymalen Stammzellen auf Knochenersatzmaterialien in vitro

  • Ziel der Arbeit war eine in vitro Versuchsetablierung einzuführen. Hierbei sollte sowohl das Überleben der Zellen (MSC und EPC), als auch ihr Verhalten unter osteogener Stimulation histologisch mittels Färbeverfahren und auf molekularbiologischem Wege untersucht werden. Dabei sollte auch ein Vergleich zwischen den zwei Medien, nämlich dem Osteogenic Stem Cell Kit und dem selbst hergestellten Medium bestehend aus Ascorbinsäure, beta-Glycerophosphat und Dexamethason gemacht werden. Hintergrund dieser Versuchsetablierung war es, eine suffiziente Behandlungsstrategie von Frakturen zu erzielen. Jene Knochendefekte, bei denen es auf Grund von bestimmten Umständen zu einer verzögerten oder gar nicht zur Bruchheilung kommt. Unter bestimmten Konditionen, wie zum Beispiel einer ausgedehnten Knochenresektion nach einer chirurgischen Tumorentfernung oder einer ausgedehnter Fraktur, entstehen großen Frakturspalten, solche, die als sog. Critical size defect bezeichnet werden. Hier für könnte eine Therapie mit der Hilfe von Tissue Engineering erzielt werden. Stromale Knochenmarkszellen haben die Fähigkeit, unter bestimmten Bedingungen, nämlich unter dem Einfluss von Ascorbinsäure, beta- Glycerophosphat und Dexamethason, sich osteogen umzudifferenzieren. Einige Studien belegen den Nutzen dieser Fähigkeit bei der Konsolidierung der Knochenfraktur. Für eine schnelle Knochenheilung ist die frühe und adäquate Vaskularisierung der Fraktur von außerordentlicher Wichtigkeit. Somit spielen die Endothelialen Progenitorzellen eine große Rolle. Nach Asahara existieren zwei unterschiedliche Klassen der EPC, CD133+ und CD133- Zellen. Verschiedene Studien zeigen, dass die EPC an der in situ Neovaskularisierung beteiligt sind. Somit stellt sich die Frage, erstmalig zu prüfen, ob eine Mischkultur aus EPC und MSC auf einer Trägermatrix kultiviert werden kann, um dadurch womöglich eine Verbesserung der Knochenheilung zu erzielen. Bei der Versuchsetablierung zeigte sich, dass die CD133+ EPC sich unter dem Einfluss von osteogenem Medium osteogen umdifferenzierten und ihre endotheliale Differenzierung nicht mehr beibehielten. Zusätzlich zeigte sich eine fehlende Adhärenzfähigkeit der CD133+ EPC. Somit wurde die Arbeit mit CD133- EPC weitergeführt. Unter osteogenem Einfluss behielten diese ihre endotheliale Differenzierung, nämlich vWF und VEGF, bei. Diese „early“ EPC waren zudem auch adhärent, was die Kultivierung auf Trägermatrices ermöglichte. Während der Versuchsetablierung zeigte sich auch, dass beta-TCP einen osteoinduktiven Einfluss auf MSC hatte. Eine synergistische Wirkung im Sinne einer Potenzierung von osteogenem Potential konnte nicht beobachtet werden. Zu klären wären noch die Nachteile, die durch beta-TCP entstehen, nämlich geringe Elastizität, langsame Resorption und hohe Zerbrechlichkeit. Daher wurde auch die Etablierung von Collagenvlies, ein Composite aus Kollagen I und Hydroxylapatite (von der Firma Osartis), untersucht. Collagenvlies war mangelhaft in seiner Stabilität. Wir konnten durch einige Modifikationen zeigen, dass die Zellen (MSC und EPC) bis einschließlich Tag 5 auf Collagenvlies vital waren. Zwar konnten Osteonektin und vWF detektiert werden, aber valide Aussagen über die osteogene Umdifferenierung der Zellen konnten auf Grund der relativ kurzen Inkubationszeit von 5 Tagen nicht getroffen werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass CD 133+ EPC unter osteogener Stimulation ihre Endotheliale Differenzierung verlieren und somit für ein Vaskularisierungsvorhaben in Frakturen unter osteogener Stimulation ungeeignet erscheinen. Zudem ist das Fehlen der Adhärenz ein entscheidender Nachteil. CD133- EPC sind adhärent und behalten ihre Endotheliale Differenzierung unter osteogener Stimulation bei. Somit sind sie auch gut geeignet, um eine für die Frakturheilung essentielle frühere Vaskularisierung zu induzieren. Die vorliegende Arbeit zeigte erstmalig erfolgreich eine in vitro Kultivierung dieser Michkultur. Es stellt sich nun die Frage, wie diese Mischkultur, bestehend aus CD133- EPC und MSC, sich in vivo verhält. Dies gilt es nun in tierexperimentellen Studien zu zeigen.
  • In this study the combined cultivation of stromal bone marrow cells (MSC) and endothelial progenitor cells (EPC) on bone substitution material( beta-TCP) was, for the first time, successfully performed. The goal of the study was the in vitro experimental establishment of a combined cultivation. In the process, both the survival of the cells (MSC and EPC) and their behavior under osteogenic stimulation could be examined histologically using dying and molecular genetic methods. Additionally, 2 different mediums were thereby compared, the Osteogenic Stem Cell Kit and a self-made mixture consisting of ascorbic acid, beta-glycerophosphate and dexamethasone. The relevance of this study lies in basic therapeutic strategies for fractures. More specifically, bone defects in which, under certain circumstances, bone healing is insufficient or completely lacking. Under such circumstances, for example extensive osseous tumor resektion or an complex fraktur, large nonunions, so-called critical size defects, result. In such cases, tissue engineering techniques can be applied. Stromal bone marrow cells have the ability of osteogenic differentiation under certain conditions, as when in the presence of ascorbic acid, beta-glycerophosphate and dexamethasone. Many studies have documented the use of this ability in the consolidation of fractures. For rapid bone healing, timely and adequate vascularization is necessary. Various studies have shown that EPC play a role in the in situ neovascularization. Thus, endothelial progenitor cells play a major role. Accordingly, it is questionable firstly, if a combined culture of MSC and EPC on a substrate matrix is at all possible in order to optimize bone healing. In this study we demonstrated that CD133+ EPC differentiate osteogenically in the presence of osteogenic medium, thereby losing their original endothilial differentiation. Additionally, it was shown that the CD133+ EPC lose their adherence. Consequently, the study was continued using CD133+ EPC. Under osteogenic influence they retain their endothelial differentiation, vWF and VEGF. These „early“EPC were also adherent, making cultivation on substrate matrix possible. Additionally, the osteoinductive influence of beta-TCP on MSC was demonstrated, although no synergetic effect in the form of potentialization could be observed. The disadvantages of beta-TCP, more specifically reduced elasticity, long resorption and high fragility were unclear. Therefore, we also examined the possible use of collegen fleece, a composite of collagen 1 and hydroxylapatite. The collagen fleece were unsatisfactory in their stability. We were able to show, after some modifications, that the cells (MSC and EPC) survived on the collagen fleece up to 5 days. While osteonectin and vWF were detectable, a valid statement concerning the osteogenic differentiation could not be made due to the relatively short incubation time of 5 days. In summary, it was demonstrated that CD133+ EPC lose their endothelial differentiation and are therefore inapplicable for vascularization in fractures. Furthermore, the lack of adherence is a decisive disadvantage. CD133- EPC are adherent and retain their endothelial differentiation under osteogenic stimulation. They are therefore applicable in inducing the early vascularization necessary in bone healing. The present study demonstrates, fort he first time, the successful in vitro cultivation of such a combined culture. The question now arises, how this combined culture of CD133- EPC and MSC behaves in vivo. This necessitates further studies using for exmple an animal model.

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Metadaten
Author:Agmal Scherzed
URN:urn:nbn:de:hebis:30-73350
Referee:Ingo MarziORCiDGND
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2009/12/22
Year of first Publication:2009
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2009/12/03
Release Date:2009/12/22
HeBIS-PPN:220568480
Institutes:Medizin / Medizin
Dewey Decimal Classification:6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht