Open Access

Fredrik John Brundin

• Stickstoffmonoxid (NO) ist ein evolutionär konservierter pleiotroper Botenstoff. Im Nervensystem fungiert NO als Transmitter, als Komponente des unspezifischen Immunsystems wirkt es bakterizid, und im kardiovaskulären System vermittelt es Vasodilatation und Inhibition der Thrombozytenaggregation. Die Regulation der Aktivität und Verfügbarkeit der drei NO-Synthase-Isoformen (NOS) ist außerordentlich komplex, erfolgt unter anderem durch zahlreiche Proteininteraktionen und ist durch eine bemerkenswerte Dynamik der subzellulären Verteilung der NOS gekennzeichnet. Die molekularen Mechanismen dieser Prozesse sind gegenwärtig nicht vollständig verstanden. NOSIP (NOS interagierendes Protein) wurde initial als ein Protein identifiziert, das die subzelluläre Verteilung von endothelialer NOS (eNOS) verändert. Überexpression von NOSIP bewirkt eine Umverteilung der eNOS von der Plasmamembran in intrazelluläre Kompartimente, die zu einer signifikanten Aktivitätsminderung führt. Im Hinblick auf die Bedeutung der subzellulären Lokalisation in der Regulation der eNOS-Aktivität und lokaler Verfügbarkeit von NO war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, die subzelluläre Verteilung von NOSIP zu charakterisieren. Immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass sich endogenes NOSIP vorwiegend im Zellkern findet. In Datenbankanalysen wurde kein klassisches nukleäres Lokalisationssignal (NLS) identifiziert. Bei genauer Betrachtung der Primärsequenz fand sich jedoch eine diskontinuierliche Sequenz mit einer Häufung basischer Aminosäuren. Sukzessive Mutation dieses hypothetischen Motivs führte zu einer Umverteilung des Proteins aus dem Zellkern ins Zytoplasma. Mittels Pulldown-Experimenten konnte gezeigt werden, dass NOSIP an das zur Kernimportmaschinerie gehörende Adapterprotein Importin-α bindet, während NLS-defiziente Mutanten nicht mehr in der Lage waren diese Interaktion einzugehen. Wie Heterokaryon-Experimente belegten, wandert NOSIP zwischen Zellkern und Zytoplasma. Dies deutet auf einen dynamischen nukleären Import- und Exportmechanismus hin, der die Grundlage für eine Interaktion mit zytoplasmatisch lokalisierter eNOS darstellt. Der nukleäre Export von NOSIP wurde durch Leptomycin B nicht beeinflusst, welches den Export von Proteinen blockiert, die eine Leucin-reiche nukleäre Export-Sequenz (NES) besitzen. Zusammengefasst belegen die in dieser Arbeit erhobenen Daten, dass NOSIP ein vorwiegend nukleäres Protein ist. Obwohl diese Verteilung durch ein atypisches zweiteiliges NLS vermittelt wird, umfasst der nukleäre Import von NOSIP die Interaktion mit Importin-α, welches typischerweise den Import von Proteinen vermittelt, die über ein klassisches NLS verfügen. NOSIP ist nicht topographisch im Zellkern fixiert, sondern wandert konstant zwischen Zellkern und Zytoplasma. Da der nukleäre Export von NOSIP nicht durch Leptomycin B beeinflusst wird, erscheint es unwahrscheinlich, dass NOSIP an die typische CRM1-Bindungsstelle für Frachtproteine bindet. Dies lässt sich gut mit der Tatsache in Einklang bringen, dass NOSIP kein Leucin-reiches NES besitzt. Unabhängige Beobachtungen unserer Arbeitsgruppe weisen darauf hin, dass NOSIP in der G2-Phase des Zellzyklus aus dem Zellkern ins Zytoplasma transloziert, wodurch eNOS in dieser kritischen Phase der Zellteilung inhibiert werden kann.
• Nitric oxide (NO) is a pleiotropic messenger found throughout evolution. In the nervous system NO functions as a transmitter, in the innate immune system it serves as a bactericide, and in the cardiovascular system it acts as a vasodilator and inhibitor of platelet aggregation. The regulation of the activity and availability of the three isoforms of NO synthases (NOS) producing NO is extraordinarily complex, e.g. through numerous proteinaceous interactions and a remarkably dynamic subcellular distribution of NOS. At present, the molecular mechanisms underlying these processes are barely understood. NOSIP (NOS interacting protein) was first identified as a protein that alters the subcellular distribution of endothelial NOS (eNOS). Overexpression of NOSIP induces redistribution of eNOS from the plasma membrane to intracellular compartments resulting in a significantly reduced eNOS activity. Given the importance of subcellular trafficking for eNOS activity and local availability of NO it was the aim of this work to study the subcellular distribution of NOSIP. Immunofluorescence microscopy revealed a prominent, though not exclusive, nuclear localization of endogenous NOSIP. Database analyses failed to identify a canonical nuclear localization signal (NLS), however inspection of the NOSIP sequence revealed a discontinuous segment rich in basic amino acids. Successive mutations of this putative motif abrogated nuclear localization and produced cytosolic distribution of NOSIP. Pulldown experiments revealed that NOSIP binds to the adapter importin-α known to be part of the nuclear transport machinery, whereas NLS deficiency abolished such binding. Heterokaryon assays demonstrated that NOSIP shuttles between the nucleus and the cytoplasm, indicating a dynamic entry and exit mechanism for NOSIP that allows for a physical encounter of NOSIP with cytosolic eNOS. Nuclear export of NOSIP was not affected by the CRM1 inhibitor leptomycin B, that blocks cargo proteins bearing a leucine-rich nuclear export sequence (NES). Together these data identify NOSIP as a predominantly nuclear protein. Although this localization is conveyed by an atypical bipartite NLS, the import mechanism of NOSIP involves importin-α which typically mediates the transport of proteins comprising a classical NLS. NOSIP is not topographically restricted to the nucleus but subject to constant nucleocytoplasmic shuttling. The indifference of the nuclear export to the presence of leptomycin B points to the fact that the typical CRM1 binding site for export cargoes is likely not involved. This finding is in line with the absence of a conventional leucine-rich NES in NOSIP. Independent observations in our laboratory have indicated that translocation of NOSIP from the nucleus to the cytosol occurs during the G2 phase of the cell cycle, allowing for an inhibition of eNOS in this critical phase of cell division.