Open Access

Daniela Meyer

• Die Verwendung von transkriptionellen Elementen des FXIIIA Gens zur Erhöhung der FVIII-Expression in megakaryozytischen und monozytischen Zellen. Berücksichtigt man den direkten Zugang zum Blutstrom, den immunologischen Hintergrund und die Beteiligung an der Blutgerinnung, wären Megakaryozyten und monozytische Zellen optimale Zielzellen für eine Gentherapie der Hämophilie A. Dennoch waren die Versuche, rFVIII in primären hämatopoetischen Zellen unter Verwendung eines CMV-Promoters zu exprimieren, bisher nicht effektiv. Ein Teil des Fehlschlagens wird der nur unzureichenden Transkription der CMVPromoter in hämatopoetischen Zellen zugeschrieben. Um die FVIII-Expression in hämatopoetischen Zellen zu verbessern, wurden regulatorische Elemente des FXIIIA-Gens in die FVIII-Expressionsvektoren einkloniert. Die Enhancer-Region (enh) und die 5’untranslatierte Region des FXIIIAGens wurden, einzeln und in Kombination, vor dem CMV-Promoter des Expressionplasmids pcDNA3.1 einkloniert. Zusätzlich zu den verstärkenden Elementen und den Promotern wurden sowohl B-Domänen-deletierter FVIII (BDD FVIII) als auch die Vollversion des FVIII („full length“ FVIII) in die Expressionsplasmide eingebaut. Die fertigen Vektoren wurden in die megakaryozytische Zelllinie K562, die humane embryonale Nierenzelllinie 293T und in CD14-Monozyten transfiziert. Als Methoden dienten die Elektroporation (Amaxa) und die Lipofektion (FuGene 6). Die Transduktionseffizienz wurde über fluoreszierende Proteine (EGFP-cDNA [N2]) gemessen, deren Sequenz in die Zellen als Kontrolle mittransfiziert wurde. Die FVIII-Expressionslevel wurden über chromogene Assays und RT-PCR analysiert. Mit dieser Studie war es uns möglich zu zeigen, dass die FVIII-Expressionsrate unter Verwendung der 5’untranslatierten Region des FXIIIA-Gens in Megakaryozyten und monozytischen Zellen signifikant gesteigert werden kann.
• Considering the immediate access to the bloodstream, the immunologic background and the involvement in coagulation, megakaryocytes and monocytes would be ideal targets for gene therapy in hemophilia A. However, several attempts to express rFVIII in primary hematopoetic cells using the ubiquitously expressed CMV-promoter have shown to be ineffective. Part of this failure was attributed to the inefficient transcription from CMV-promoters in hematopoetic cells. To improve FVIII expression in hematopoetic cells, regulatory elements of the FXIIIA gene were introduced into FVIII expression vectors. The enhancer region (enh) and the 5 prime untranslated region (5’UTR) of the FXIIIA gene were cloned as single elements or in combination upstream of the CMV-promoter into the mammalian expression plasmid pcDNA3.1. Either B domain deleted FVIII (BDD FVIII) or full length FVIII (FVIII-fl) cDNA were subsequently cloned into the vectors containing the FXIIIA transcriptional regulatory elements. These vectors were transfected into CD14+ monocytes, the megakaryocytic cell line K562 and the human embryonic cell line 293T using nucleofection (Amaxa) and lipofection (FuGene6). Transfection efficiency was measured by green fluorescent protein (GFP) expression and FVIII expression level were measured using a two stage chromogenic assay and RT-PCR analysis. In this study we were able to show that the use of the 5 prime untranslated region (5’UTR) of the FXIIIA gene can significantly increase the expression of FVIII in megakaryocytes and monocytes.