Open Access

Stefan Rupp

• Kardiovaskuläre Erkrankungen nehmen einen großen Sektor des gegenwärtigen Krankheitsspektrums ein. Die Entdeckung von Stammzellen, die sich zu Gefäßen oder Herzmuskelzellen entwickeln können, bietet neben bereits etablierten Behandlungen völlig neue therapeutische Ansatzpunkte zur kardialen Regeneration dieser Patienten. Neben embryonalen oder adulten Stammzellen kommen auch leicht aus dem peripheren Blut zu gewinnende endotheliale Vorläuferzellen für mögliche Therapien in Frage. Um den Ansatz der Differenzierung von Stamm- oder Vorläuferzellen in Herzmuskelzellen in vitro zu untersuchen, wurde ein bereits bekanntes Modell der Ko-Kultur von neonatalen Rattenkardiomyozyten mit verschiedenen Populationen von Stamm- oder Vorläuferzellen genutzt. Anlehnend an dieses Modell wurden in dieser Arbeit EPCs für sechs Tage zusammen mit neonatalen Kardiomyozyten der Ratte kultiviert. Es zeigt sich, dass EPCs nach sechs Tagen Ko-Kultur mit neonatalen Rattenkardiomyozyten in der Lage sind, zu Kardiomyozyten zu differenzieren und typische kardiomyozytäre Eigenschaften aufweisen, zu denen beispielsweise die Expression kardiospezifischer Proteine gehören sowie die Integration mit umliegenden Kardiomyozyten. Nach Etablierung dieses Versuchsansatzes wurde die Differenzierungskapazität der EPCs KHK erkrankter Patienten untersucht, sowie der Einfluß von Statineinnahme der Patienten, da eine prinzipielle Wirkung der Statine auf EPCs bereits vielfach beschrieben wurde. Es zeigt sich, dass auch EPCs von KHK-Patienten in der Lage sind, zu Kardiomyozyten zu differenzieren, wobei eine verringerte Differenzierungsrate zu beobachten ist. Durch Behandlung der Patienten mit Statinen lässt sich diese verringerte Kapazität verbessern, wie sich nicht nur in einer Querschnittsuntersuchung, sondern auch im prospektiven Verlauf gezeigt hat. Der Mechanismus, über den Statine eine Verbesserung der EPC-Differenzierung erreichen, ist nicht geklärt. Interessanterweise sind Statine in vitro nicht in der Lage, die EPCDifferenzierung zu Kardiomyozyten zu verbessern. Der vielversprechende Ansatz der Regeneration von Gewebe durch Stammzellen wird durch die vergleichsweise geringe Ausbeute an differenzierten Zellen limitiert. Aus diesem Grunde wurden verschiedene Versuche durchgeführt, die Differenzierungsrate in vitro anzuheben. Leider zeigen VEGF (beschrieben ist beispielsweise ein positiver Effekt auf Überleben und Migration), 5’-Azacytidine (Erhöhung der Differenzierungsrate embryonaler Stammzellen) oder hypoxisch-konditioniertes Medium (Erhöhung der Differenzierung von Stammzellen in neurales Gewebe) keinen positiven Effekt auf die EPC-Differenzierungsrate zu Kardiomyozyten. Von grundlegender Bedeutung ist es, die Mechanismen der Differenzierung von Stamm- oder Vorläuferzellen aufzuklären. Erschwert wird diese Aufgabe durch die Möglichkeit, dass in verschiedenen Geweben verschiedene Mechanismen (Zellfusion auf der einen und Transdifferenzierung auf der andere Seite) für die Stammzellintegration verantwortlich sein könnten. Mithilfe einer Ko-Kultur der EPCs mit fixierten Kardiomyozyten konnte gezeigt werden, dass die Differenzierung der EPCs zu Kardiomyozyten den direkten Kontakt zu anderen Kardiomyozyten benötigt, jedoch nicht zwingend auf einer Zellfusion basiert. Um den Differenzierungsprozess weiter zu untersuchen, wurden die für die Zell-Zell- oder Zell-Matrix- Interaktion wichtigen Proteine untersucht. In einem Blockierungsversuch der für die Zell-Matrix- Interaktion wichtigen Integrine, ließ sich kein Nachweis für eine Rolle der Integrine für den Differenzierungsprozess erbringen. Für die Zell-Zell- Interaktion stellen die kalziumabhängigen Cadherine eine wichtige Gruppe dar. In einer Ko-Kultur, die in einem kalziumfreien Medium durchgeführt wurde, ließ sich eine signifikante Reduktion des Überlebens der EPCs feststellen. Ein weiterer Versuch, der mit einer Mischung verschiedener Cadherin-blockierender Antikörper durchgeführt wurde, zeigt eine signifikante Reduktion der Differenzierung der EPCs in Kardiomyozyten. Die Untersuchung, welches Cadherin für den Differenzierungsprozess eine besondere Bedeutung spielt, ist Gegenstand gegenwärtiger Untersuchungen. Diese Doktorarbeit zeigt, dass EPCs prinzipiell in der Lage sind, in Kardiomyozyten zu differenzieren. Ebenso sind EPCs KHK-erkrankter Patienten in der Lage in Kardiomyozyten zu differenzieren, jedoch zu einem geringeren Prozentsatz. Statinbehandlung steigert den Prozentsatz der EPC-Differenzierung bei KHK-erkrankten Patienten. Mit medikamentöser Behandlung (beispielsweise Statineinnahme) könnte der Stammzelltherapieansatz bei KHK-erkrankten Patienten unterstützt werden. Erste Hinweise für den komplexen Prozess der Progenitorzelldifferenzierung weisen auf einen kalziumabhängigen, Cadherin-vermittelten Mechanismus hin.
• Coronary artery Disease (CAD) plays a major role in the health system today. In addition to the clinically established treatments for patients with CAD, a new therapeutic approach may be to regenerate the ischemia-damaged heart by stem or progenitor cells. Stem cells are capable of differentiating into a large diversity of cells including cardiomyocytes. Therefore, embryonic and adult stem cells are currently investigated for cell therapy applications. Endothelial progenitor cells (EPC), a population of cells which can be easily cultivated from peripheral blood, may offer a cell source capable of cardiac regeneration. EPCs, isolated from peripheral blood, were cultivated for six days together with neonatal rat cardiomyocytes. After six days of co-culture, some co-cultivated EPCs displayed typical characters of cardiomyocytes as evidenced by integration with surrounding cardiomyocytes and the expression of cardiac proteins such as α-sarcomeric actinin, MEF-2, and troponin T. After establishing the new method, the differentiation capacity of the EPCs into cardiomyocytes in the co-culture system was determined in patients with CAD. Further to the differentiation capacity of EPCs from patients with CAD, the differentiation capacity of CAD patients treated with statins was investigated, because CAD patients clinically benefit from a statin treatment. Interestingly, EPCs, cultivated from patients with CAD, revealed a significant lower number of α-sarcomeric actinin-positive cells after six days of co-culture compared to healthy controls. The number of differentiated EPCs after co-culture was significantly higher in patients treated with statins compared to CAD patients not treated with statins. In addition, the prospective treatment of CAD patients with statins also significantly increased the number of differentiated EPC. The mechanism by which statins affect the differentiation capacity remains unclear. Interestingly, statins were not able to augment the differentiation rate in vitro. However, the promising idea of stem cell therapy is limited by the relatively small amount of differentiated stem cells. For this reason, different experiments were performed in an attempt to raise the differentiation rate in vitro. Unfortunately, adding VEGF, 5´-Azacytidine or hypoxic-conditioned medium did not show any increase in the differentiation rate of EPCs into cardiomyocytes. Using the method of a co-culture with fixed cardiomyocytes, we demonstrated that direct contact with surrounding cardiomyocytes was necessary for the differentiation of EPCs into cardiomyocytes. Although cell fusion can occur, our data indicate that the differentiation of EPC to cardiomyocytes in the co-culture system does not depend on cell fusion. In order to examine the differentiation process, we examined the role of integrins and cadherins which are important for mediating cell-matrix or cell-cell interactions. In an experimental setting with integrin-blocking peptides, we could exclude a major role of integrins for the process of differentiation. Calcium-dependent cadherins mediate cell-cell interaction. Using a co-culture in calcium-free medium, a significant reduction of the survival rate of EPCs could be determined. Similarly, addition of a mixture of different cadherin-blocking antibodies yielded a significant reduction of EPC-differentiation into cardiomyocytes. The identification of the cadherin(s) playing a major role for the differentiation process remains a subject of further investigations. In summary, this thesis provides evidence that EPCs from healthy controls and also from CAD patients can acquire a cardiomyogenic phenotype. Secondly, EPCs from CAD patients show a reduced differentiation rate into cardiomyogenic cells. Additionally, statin treatment of CAD patients improved their EPC differentiation rate into cardiomyogenic cells. The fact that treatment of CAD patients with statins shows an increased differentiation rate of EPCs into cardiomyocytes may be used in therapeutic autologous transplantation of EPCs inpatients with ischemic heart disease. Finally, differentiation of EPCs into cardiomyocytes is calcium-dependent and cadherin-mediated.