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Corina Hunger

• Ziel dieser Dissertation war es, grundlegende Untersuchungen zum massenspektrometrischen Nachweis von DNA und RNA durchzuführen, sowie der spezifische Nachweis von nichtkovalenten Oligonukleotid-Komplexen. Dabei lag der Schwerpunkt auf den folgenden drei Bereichen: - Allgemeiner Vergleich zwischen DNA und RNA sowie den Ionisierungsmethoden nano-ESI und MALDI - Quantitative Untersuchung des Einflusses des Salzgehaltes und der Aufreinigung der Probe auf das Spektrum - Grundlegende Vorraussetzungen zum spezifischen Nachweis nichtkovalenter Komplexe mittels Massenspektrometrie (MS) Dabei zeigte sich beim massenspektrometrischen Vergleich von DNA mit RNA, dass die RNA stets eine höhere Stabilität aufweist, wobei diese bei beiden Oligonukleotiden mit steigender Kettenlänge abnimmt. Gleichzeitig erhöht sich mit steigender Kettenlänge die Tendenz zur Kationenanlagerung im Spektrum. Um diese Anlagerungen zu unterdrücken, ist die Verwendung von ammoniumhaltigen Zusätzen ist bei der MS stets erforderlich. Bei MALDI haben die Matrices einen großen Einfluss auf das Fragmentierungsverhalten der Proben. Für die Oligonukleotide konnte daher folgende Einteilung der Matrices von „hart“ nach „weich“ getroffen werden: HCCA > DHB > THAP ungefähr gleich ATT > HPA. Bei der Untersuchung von Oligonukleotiden mittels nano-ESI konnte gezeigt werden, dass die Verwendung von Quarzkapillaren der Verwendung von Glaskapillaren vorzuziehen ist, da mit Quarz die Anlagerungen der Kationen im Spektrum deutlich unterdrückt werden. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Erhöhung des Drucks in der ersten Druckstufe zu einer schonenderen Desolvatisierung und damit zu einer deutlich verbesserten Nachweisgrenze führt. Bei der quantitativen Untersuchung des Salzeinflusses konnte eine maximale Salzkonzentration ermittelt werden, bei der eine massenspektrometrische Untersuchung von DNA und RNA noch möglich ist. Dabei hat sich gezeigt, dass bei direktem Vergleich nano-ESI 1000fach empfindlicher auf Salzverunreinigungen reagiert als MALDI. Generell lässt sich sagen, dass RNA eine höhere Tendenz zur Kationenanlagerung besitzt als DNA, wobei sich dieser Effekt mit steigender Kettenlänge verstärkt und bei nano-ESI deutlicher auftritt als bei MALDI. Das hat zur Folge, dass bei RNA ein höherer Aufreinigungsgrad notwendig ist, um im Vergleich zu DNA vergleichbare Ergebnisse zu erhalten. Dem entsprechend wurden neben der Aufreinigungsmethode mittels Ionenpaar-HPLC auch verschiedene Pipettenspitzen, die mit Chromatographiematerial gefüllt sind, zur Aufreinigung verwendet. Mit beiden Methoden konnte eine vergleichbare Reduktion der Kationenanlagerungen im Spektrum erreicht werden, wobei klar ist das die Verwendung von Pipettenspitzen die zeit- und kosteneffizientere Lösung darstellt. Durch ein neuartiges Aufreinigungsprotokoll für Pipettenspitzen konnte der Zeitaufwand noch einmal deutlich reduziert werden. Für die Untersuchung nichtkovalenter Oligonukleotid-Komplexe wurden „native“ Bedingungen gefunden, bei der die native Struktur des Komplexes soweit erhalten bleibt, dass ein spezifischer Nachweis mittels nano-ESI möglich ist. Diese Bedingungen stellen einen Kompromiss zwischen einerseits der Stabilität des Komplexes in Lösung und andererseits den optimalen Bedingungen für die Elektrospray-Ionisierung dar. Die erste untersuchte Komplexklasse waren Oligonukleotid-Dimere. Es wurden verschiedenste DNA-, RNA- sowie DNA-RNA-Hetero-Dimere mit Bindungsenergien zwischen 0 und -22,1 kcal/mol mittels nano-ESI vermessen. Es wurde eine klare Grenze ermittelt, bei der die Detektion nichtkovalenter Komplexe möglich ist. Spezifischen Dimere können im Spektrum nur dann detektiert werden, wenn deren Bindungsenergie mindestens -11,5 kcal/mol oder mehr beträgt. Als zweite Gruppe wurden Oligonukleotid-Dimere mit „Minor Groove Binding Ligands“ (MGBLs) mittels nano-ESI untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die MGBLs spezifisch und in der entsprechenden Bindungsstöchiometrie an DNA-Dimere binden. Für einen neusynthetisierten Ligand konnte erstmals die Bindungspräferenz an DNA-Dimere mit der Massenspektrometrie bestätigt werden. In allen Fällen wurde keine unspezifische Bindung an RNA-Dimere oder DNA-RNA-Hetero-Dimere beobachtet. Als letztes wurden RNA-Aminoglykosid-Komplexe mit nano-ESI untersucht. Hierbei konnten nur teilweise spezifischen Komplexe im Spektren nachgewiesen werden, da die Bindungsenergie einiger Komplexe deutlich unterhalb der Nachweisgrenze von -11,5 kcal/mol lag. Alle genannten nichtkovalenten Komplexe wurden auch mittels MALDI vermessen, allerdings konnten keine spezifischen Komplexe nachgewiesen werden. Durch direkten Vergleich von MALDI mit nano-ESI und entsprechende Kontrollexperimente konnte erstmals gezeigt werden, dass die nichtkovalenten Komplexe nicht wie vermutet während der MALDIKristallisation zerstört werden. Viel mehr werden die Komplexe im MALDI-Kristall unzerstört eingebaut und eine Zerstörung erfolgt erst während des Desorptions-/Ionisationsprozesses. Es besteht die berechtigte Vermutung, dass bei stärker bindenden Komplexen eine unzersetzte Ionisation mittels MALDI erfolgen kann. Daher sind weitere Untersuchungen in diese Richtung sinnvoll und es werden zur Zeit Komplexe, deren Bindungsenergie weit über -22,1 kcal/mol liegt, in der Arbeitsgruppe untersucht. Abschließend ist festzustellen, dass die Massenspektrometrie eine schnelle und effiziente Möglichkeit zur Analyse von DNA und RNA ist, die allerdings einen hohen Anspruch an die Sauberkeit und damit an die Aufreinigung der Probe stellt. Darüber hinaus ist die MS auch in der Lage nichtkovalente Oligonukleotid-Ligand-Komplexe zu untersuchen. Da in den letzten Jahren DNA und RNA als mögliches Zielmolekül für neue Therapieansätze mehr und mehr an Bedeutung gewonnen haben, bietet sich die Massenspektrometrie als eine Möglichkeit zur Analyse von Oligonukleotid-Wirkstoff- Komplexe an.
• The aim of this thesis was the principle investigation of DNA and RNA and the specific detection of non-covalent oligonucleotide-complexes. The main objectives were: - a general comparison between DNA and RNA and between the different ionization techniques nano-ESI and MALDI; - the quantitative investigation of the influence of the salt content and the purification level on the spectrum; - the elucidation of basic requirements for the specific detection of non-covalent complexes in mass spectrometry. RNA shows a higher stability compared with DNA, while for both oligonucleotides the stability decreases with increasing chain length. At the same time the tendency to bind cations increases with increasing chain length. To suppress the complexation of alkali cations in MS, the use of ammonium containing additives is necessary. The matrix used has a great influence on the fragmentation behavior of the samples in MALDI. For oligonucleotides, a sequence of matrices could be established as follows (“hard” to “soft”): HCCA > DHB > THAP ~~ ATT > HPA. The usage of quartz capillaries instead of glass capillaries is recommended for the investigation of oligonucleotides by nano-ESI, because the amount of cation attachment can be reduced ignificantly with quartz. It was also ascertained, that the increase of the pressure in the first pumping stage leads to a “softer” desolvatization and therefore to an enhanced detection limit. By quantitative investigation of the influence of the salt content a maximum salt concentration was established at which a mass spectrometric investigation of DNA and RNA was still possible. Nano-ESI has been found to be more sensitive to salt concentration than MALDI by a factor of 1000. In general, RNA has a higher tendency to bind cations than DNA. This effect increases with increasing chain length and it is more prominent with nano-ESI than with MALDI. This implies that RNA needs a higher purification level to achieve the same result than for DNA. Correspondingly different pipette tips, which where filled with chromatographic material, were used for purification as well as ion-pair-HPLC. The same reduction of cation adduct could be achieved with both methods, but it is clear that the usage of pipette tips is the more time- and cost-efficient alternative. With a novel purification protocol the time needed could be reduced even further. For the investigation of non-covalent oligonucleotide-complexes “native” conditions were found, at which the native structure of the complexes was insofar retained, that a specific detection with nano-ESI was possible. These conditions represent a compromise between the stability of the complex in solution and optimal conditions for electrospray ionization. The first class of complexes investigated were oligonucleotide-dimers. Different DNA-, RNA as well as DNA-RNA-hetero-dimers with binding energies between 0 and -22,1 kcal/mol were investigated by nano-ESI. A clear cut-off could be determined, at which the detection of non-covalent complexes was still possible. Specific dimers can only be detected, if their binding energy is at least -11,5 kcal/mol or more. The second class of oligonucleotide-dimers that were investigated by nano-ESI, were complexed with “minor groove binding ligands” (MGBL). It could be shown that the MGBL bind specifically and only in the right binding stoichiometry to the dimers. For a newly synthesized ligand the binding preference to DNA could be determined for the first time by mass spectrometry. In all cases no unspecific binding to RNA-dimers or DNA-RNA-heterodimers was detected. As a third class of non-covalent complexes, RNA-aminoglycoside-complexes were investigated by nano-ESI. Hereby only some of the complexes could be specifically detected in the spectra, because some of their binding energies were clearly below the detection limit of -11,5 kcal/mol. All non-covalent complexes mentioned above were also investigated by MALDI, however no specific complexes could be detected. By direct comparison of MALDI with nano-ESI and adequate control experiments it could be shown for the first time, that non-covalent complexes are not destroyed during MALDI-crystallization, as previously suggested. The complexes are rather incorporated in the MALDI-crystal and the decomposition of the complexes occurs later on during the desorption/ionization process. The non-destructive ionization of stronger binding complexes with MALDI should therefore be possible. Additional investigations are currently under way. To sum up, it can be said that mass spectrometry is a fast and efficient method for the investigation of DNA and RNA, which needs pure and consequently highly purified samples. Furthermore the investigation of non-covalent oligonucleotide-ligand-complexes is possible with MS. As DNA and RNA became more and more a potential drug target for new therapy approaches in the last years, mass spectrometry provides a fast possibility for the analysis of oligonucleotide-drug-complexes.