Entwicklung retroviraler scFv-display-Bibliotheken und Expression therapeutischer Proteine durch replikationskompetente retrovirale Vektoren

Establishment of retroviral scFv display libraries and expression of therapeutic proteins via replication competent retrovrial vectors

  • Der derzeitige Stand der Gentherapie bedarf der Entwicklung neuer Systeme zur Selektion bislang unbekannter Proteine und zur Verbesserung der Gentransfereffizienz viraler Vektorsysteme. Bisher verwendete Systeme wie Phagen display bergen erhebliche Nachteile, die alle auf die Verwendung von Prokaryonten zurückzuführen sind. Deswegen wurde in der vorliegenden Arbeit ein System entwickelt, welches eine Selektion und Produktion von Proteinen im stets eukaryonten Kontext ermöglicht. Dazu wurde ein ein replikationskompetenter retroviraler Vektor entwickelt durch den eine erhebliche Steigerung der Gentransfereffizienz möglich ist. Beide Teilaspekte meiner Arbeit beruhen auf Modifikationen unterschiedlicher Stämme des Maus Leukämie Virus (MLV). Zur Selektion von Proteinen im eukaryonten Kontext wurde erstmalig eine retrovirale display Bibliothek etabliert, wobei ecotropes MLV varible Antikörper-Fragmente (scFv´s) auf der Oberfläche präsentiert. Eine Modellselektion mit dem Antigen Laminin, simuliert durch das Mischen von zwei erstellten Virusvarianten (7A5 Xa Mo/ L36 Xa Mo) in unterschiedlichen Konzentrationen, konnte die Selektion der Laminin-bindenen Variante L36 Xa Mo aus einem Überschuß von 10 hoch -4 nicht bindender 7A5 Xa Mo zeigen. Die Anreicherung der bindenden L36 Xa Mo Variante konnte ebenfalls aus dem Kontext einer erstellten retroviralen alphaHUVEC Bibliothek erzielt werden. Die Anwendbarkeit des Systems wurde durch diese Modellselektionen sowie durch die Selektion der alphaHUVEC Bibliothek auf VEGFR-1 als Antigen demonstriert. Derart selektionierte Proteine konnten im nächsten Schritt, unter Verwendung einer Furinspaltstelle im Hüllprotein des amphotropen MLV, in verschiedenen Zelllinien produziert werden. Gezeigt werden konnte eine effiziente Produktion und Sezernierung der verwendeten scFv´s bis zu einer Konzentration von 6µg/ml im Zellkulturüberstand, wobei der Tropismus des amphotropen MLVs nicht beeinflußt wurde. Die biologische Aktivität derart hergestellter Proteine, konnte mittels FACS und ELISA nachgewiesen werden. Eine Abtrennung von den viralen Bestandteilen kann durch Filtration mit molekularer Ausschlußgrenze erzielt werden. Besonders hervorzuheben ist die genomische Stabilität derart mordifizierter Viren. Trotz des zusätzlichen Leserahmens war das auf die beschriebene Weise modifizierte MLV über 12 Infektionszyklen genetisch stabil und gewährleistete so erstmalig eine stetige Produktion der gewünschten Proteine. Die erfolgreiche Anwendung dieses Vektorsystems zur Tumortherapie erwies sich bereits in weiterführenden Arbeiten.
  • The present state of the genetic therapy needs the development of new systems to the selection of up to now unknown proteins and for the improvement of the genetic transfer efficiency of viraler vector systems. Up to now used systems like Phagen display rescue considerable disadvantages which are to be led back everything on the use of Prokaryonten. So a system which allows a selection and production of proteins in the always eukaryonten context was developed in the present work. In addition a replication-competent retroviraler vector was developed one by one considerable increase of the genetic transfer efficiency is possible. Both partial aspects of my work are based on modifications of different trunks of the mouse leukaemia virus (MLV). To the selection of proteins in the eukaryonten context it was set up first retrovirale display library and ecotropes MLV varible antibody fragments (scFv's) on the surface present arms.

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Metadaten
Author:Carsten Finger
URN:urn:nbn:de:hebis:30-29847
Referee:Christian Buchholz
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2006/07/14
Year of first Publication:2005
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2006/07/04
Release Date:2006/07/14
Tag:display Bibliotek; retrovirale Vektoren; scFv
display library; retroviral vectors; scFv
GND Keyword:Gentherapie
HeBIS-PPN:179529927
Institutes:Biowissenschaften / Biowissenschaften
keine Angabe Fachbereich / keine Angabe Institut
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht