Open Access

Kerstin Fella

• Die heutige moderne Toxikologie ist dem 3-R-Prinzip (Russel und Burch, 1959), einem Konzept zur Verminderung und Verkürzung von Tierversuchen, verpflichtet. Allerdings stellt insbesondere die für die Zulassung und Registrierung neuer Arzneistoffe oder Chemikalien behördlich geforderte Prüfung von Substanzen auf kanzerogene Eigenschaften immer noch einen langwierigen Prozess mit einem hohen Bedarf an Versuchstieren dar. Daher sollte unter dem Einsatz von Methoden der Proteomforschung eine Identifizierung und Charakterisierung neuer Protein-Biomarker erfolgen, die eine verbesserte Vorhersage von Prozessen der chemisch induzierten Leberkanzerogenese erlauben. Motivation für diese Arbeiten war die Annahme, dass durch chemische Substanzen angestoßene molekulare Prozesse mit proteinanalytischen Methoden früher detektierbar sind als dies mit konventionellen toxikologischen Methoden möglich ist, welche vor allem die Prüfung von Substanzen im Tierversuch mit anschließender histopathologischer und klinisch-biochemischer Bewertung der toxischen Effekte vorsehen. Die Untersuchungen sollten Aufschluss darüber geben, ob Proteomstudien die traditionelle Toxikologie mit einer verbesserten, insbesondere verkürzten Erkennung und Aufklärung toxischer Wirkmechanismen unterstützen können. In der Zukunft würde dies eine signifikante Verkürzung und Verbesserung von Tierversuchen bedingen, verbunden mit einer Verringerung der Anzahl an Versuchstieren und letztlich einer Einsparung von Kosten und Zeit. N-Nitrosomorpholin (NNM), ein bekanntes Leberkanzerogen, diente als Modellsubstanz zur Abbildung des Kanzerogeneseprozesses. Zur Induktion von Lebertumoren sowie frühen präneoplastischen Veränderungen wurden Ratten in zwei Tierstudien über definierte Zeiträume mit zwei unterschiedlichen Dosierungen NNM behandelt. Das nach verschiedenen Behandlungszeitpunkten gewonnene Lebergewebe diente als Ausgangsmaterial für die nachfolgenden proteomischen Analysen. Dazu kam vor allem die zweidimensionale Gelelektrophorese (2-DE) zum Einsatz, gefolgt von MALDI-Massenspektrometrie (MS) zur Identifizierung differentiell exprimierter Proteine. Ausserdem wurden aus den Leberproteinextrakten unter Einsatz der SELDI (Surface Enhanced Laser Desorption and Ionisation)-Technologie Proteinprofile erstellt und für die verschiedenen durch NNM-Behandlung aufgetretenen Leberveränderungen charakteristische Signalmuster ermittelt. Das Potential der iTRAQ-Technologie, einer MS-basierten Quantifizierungsstrategie wurde in einem weitergehenden Schritt ermittelt. Mittels 2-DE/MS-Analyse konnten einerseits Proteine identifiziert werden, deren vermehrte Expression die nach einem Tag der Behandlung mit NNM ausgelösten akut toxischen Effekte der Chemikalie in der Leber reflektierten. Andererseits lieferte die Analyse von Proben, in denen nach 25 Wochen Lebertumore diagnostiziert wurden, differentiell exprimierte Proteine, die als Tumor-spezifische Markerproteine charakterisiert werden konnten. Im Hinblick auf das vorrangige Ziel der Arbeit, neue Biomarker zu identifizieren, die schon zu einem frühen Zeitpunkt des Tierversuchs bereits einsetzende kanzerogene Prozesse aufzeigen und damit in der Zukunft einen Beitrag leisten könnten, konventionelle toxikologische Prüfmethoden zu unterstützen oder gar zu verkürzen, erfolgte eine Fokussierung der Analyse auf Proben von Tieren, die drei Wochen lang mit NNM behandelt wurden. Bereits zu diesem Zeitpunkt wurden Proteine detektiert, deren Deregulation mit frühen Prozessen der Leberkanzerogenese in Einklang gebracht werden konnte. Vor allem 18 Proteine, die sich in den Proben nach drei Wochen der NNM-Behandlung wie auch in dem Gewebe von Tieren mit Tumoren als dereguliert erwiesen, wurden als potentielle frühe Biomarker mit einem enormen Potential zur verbesserten Vorhersage von Leberkanzerogenese charakterisiert. Um die durch 2-DE/MS-Analyse ermittelten potentiellen frühen Biomarker in ihrem detektierten Regulationsmuster zu bestätigen und damit das Vertrauen in die 2-DE/MS-Ergebnisse zu erhöhen, erfolgte eine Prävalidierung der Markerproteine mit unabhängigen Methoden. Hierfür wurde der immunologische Nachweis der Proteine in Form des Western Blottings sowie eine MS-basierte Quantifizierung unter Anwendung der iTRAQ-Technik herangezogen. Des Weiteren eröffnete die Integration der Arbeit in ein Verbundprojekt die Möglichkeit zum Vergleich der Proteinexpressionsdaten mit den Ergebnissen der globalen Genexpressionsanalyse, die bei einem Projektpartner durchgeführt wurde. Während durch Western Blotting nur wenige der 18 potentiellen frühen 2-DE/MS-Biomarker in ihrer nach drei Wochen Behandlung beobachteten Regulation bestätigt werden konnten, wurden durch Einsatz der iTRAQ-Technik 11 der Biomarker verifiziert und damit der Wert dieser Quantifizierungsstrategie für den Ansatz der Prävalidierung unterstrichen. Der Abgleich mit den Genexpressionsdaten legte für 63% der Proteine eine übereinstimmende Deregulation auf Genniveau offen. Insgesamt wurden 13 der 18 potentiellen frühen 2-DE/MS-Biomarker durch mindestens eine weitere unabhängige Technologie in ihrer im 2-DE-Gel beobachteten Expressionsveränderung bestätigt. Zusammenfassend lieferte die 2-DE/MS-Analyse des durch NNM veränderten Lebergewebes zahlreiche Protein-Biomarker, die auf molekularer Ebene sowohl frühe als auch späte Stadien der Leberkanzerogenese reflektieren. Vor allem die charakterisierten potentiellen frühen Biomarkern weisen ein signifikantes Potential auf, in der Zukunft konventionelle toxikologische Prüfsysteme zu unterstützen und möglicherweise einen Beitrag zur Verkürzung von Tierstudien und damit zur Einsparung von Versuchstieren zu leisten. Durch Prävalidierung der meisten der frühen Markerproteine durch unabhängige Methoden wurde dieses Potential als auch der Wert von Methoden der Proteomforschung zur allgemeinen Unterstützung der prädiktiven Toxikologie noch einmal unterstrichen.
• Today, modern toxicology is committed to the 3Rs concept which states to replace, to refine and to reduce animal testing whenever possible. Nevertheless, the evaluation of risk for human health arising from toxic effects of new drug candidates, as well as chemical compounds, is still largely based on animal studies combined with histopathological and biochemical methods. Investigation of carcinogenicity is usually performed using two-years studies in rodents. Carcinogenicity studies are time- and cost-intensive and, additionally, animals might suffer due to the chronic treatment. Therefore, in the current work proteomic technologies were implemented for identification and characterization of new protein biomarkers which allow an improved prediction of molecular processes of chemically induced hepatocarcinogenicity. This work was motivated by the assumption that the induced molecular processes might be detectable earlier by proteomic techniques than by conventional toxicology methods. The investigations should reveal if proteome studies might be able to support traditional toxicology with an improved and shortened recognition of toxic effects. This would contribute to significantly shorten and improve animal testing in the future, combined with a reduced amount of animals required and a decrease in time and costs. N-nitrosomorpholine (NNM), a well characterized liver carcinogen, was used as model compound for induction of liver tumors as well as early preneoplastic lesions in rats. In two studies animals were treated over defined time periods with two different doses of NNM. The liver samples, taken at different timepoints of treatment, were used for the following proteome analyses. These were performed using two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) followed by MALDI mass spectrometry (MS) for identification of differentially expressed proteins. Futhermore, SELDI (Surface Enhanced Laser Desorption and Ionisation) technology was utilized for analysis of rat liver proteins in order to generate protein profiles which can be used as signal patterns characteristic for the different phases of NNM treatment. In addition, the usefulness of iTRAQ-technology, an MS based quantitation strategy, for prevalidation of identified 2-DE/MS biomarkers was evaluated. After one day of NNM exposure, 2-DE/MS analysis revealed several differentially expressed proteins which reflect a cellular response to acute toxic effects of NNM. Furthermore, after 25 weeks, when tumors were detected in most of the liver samples, several of the identified deregulated proteins were characterized as marker proteins specific for neoplastic tissue. Regarding the main target of this work, the identification of new biomarkers, which reflect molecular carcinogenic processes at an early timepoint during the animal study, the following 2-DE/MS analysis focused on rat liver tissue which was exposed to NNM for only three weeks. The deregulation of most of the proteins, identified at this timepoint, could be correlated with molecular changes involved in early processes of liver carcinogenicity. Specifically, 18 proteins which showed a differential expression after three weeks of exposure as well as after 25 weeks, were characterized as potential early protein biomarkers with an enourmous impact for imoproved prediction of liver carcinogenicity in the future. A verification/prevalidation of the 18 potential 2-DE/MS biomarkers was performed by using Western Blot analysis as well as iTRAQ reagent technology, an MS-based quantitation strategy. Furthermore, integration of this work in a cooperative project allowed the comparison of protein expression data with the results of global gene expression analysis performed by a project partner. Whereas only little correlations could be observed by Western Blot analysis, the regulation of 11 of the 2-DE/MS biomarkers could be verified by using iTRAQ reagents so that this quantitation strategy turned out as useful approach for biomarker prevalidation. In addition, comparison with gene expression data revealed a correlation of 63% so that in summary, 13 of the 18 potential early 2-DE/MS biomarkers could be verified by more than one independent technology. Taken together, these 13 proteins might act as robust early biomarkers with the power to support conventional toxicology routine studies in order to improve and shorten animal studies in the future.