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Jörg Standfuß

• Die bei der Photosynthese verwendete Lichtenergie wird zu einem großen Anteil von Lichtsammlersystemen bereitgestellt. In der pflanzlichen Photosynthese wird unterschieden zwischen Lichtsammlersytem I (light harvesting complex I, LHC-I), assoziiert mit Photosystem I (PS-I) und Lichtsammlersystem II (light harvesting complex II, LHC-II), assoziiert mit Photosystem II (PS-II). LHC-II ist der häufigste Protein-Pigment Komplex der Chloroplasten und bindet bis zu 50% aller Chlorophylle in der Thylakoidmembran. Der Protein-Pigment Komplex LHC-II hat vier, teils miteinander verwandte Funktionen in der Photosynthese. I) Die Sammlung und Weiterleitung von Lichtenergie, II) Stabilisierung der Granastapel, III) Ausgleich der Anregungsenergie von PS-I und PS-II, IV) Schutz der Photosynthese vor Überanregung mittels nichtphotochemischer Eliminierung von Anregungsenergie (NPQ). In der Pflanze bildet LHC-II Trimere in verschiedenen Kombinationen dreier Isoformen (Lhcb1, Lhcb2 und Lhcb3), wobei Lhcb1 mit 70-90% den Hauptteil des LHC-II stellt. Jedes Monomer bindet 8 verschiedene Co-Faktoren in unterschiedlichen Mengen, die ca. 30% seiner Masse ausmachen. Die drei Isoformen des LHC-II sind in allen Pflanzen stark konserviert. Die funktionelle Bedeutung der Isoformen ist jedoch weitestgehend unklar. Dies liegt vor allem an der schwierigen Isolierung reiner Isoformen aus Pflanzenmaterial. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden deshalb alle drei Isoformen rekombinant hergestellt und mit getrennt isolierten Lipiden und photosynthetischen Pigmenten in ihre native Form gefaltet. Die anschließende biochemische und spektroskopische Charakterisierung zeigte einen hohen Grad an Homologie zwischen den drei Isoformen, wobei Lhcb3 die größten Unterschiede aufwies (Standfuss und Kühlbrandt 2004). Die wahrscheinlichsten Funktionen für Lhcb1 und Lhcb2 ist die Anpassung der Photosynthese an variierende Lichtbedingungen. LHC-II Heterotrimere mit Lhcb3 Anteil könnten an der Weiterleitung von Lichtenergie von der Haupt Lhcb1/Lhcb2 Antenne zum PS-II Reaktionszentrum beteiligt sein. Für die Erforschung des LHC-II war das mittels Cryo-Elektronenmikroskopie an 2D Kristallen erstellte atomare Modell des Komplexes von enormer Bedeutung. Ein tiefes Verständnis der Funktionen des LHC-II benötigt jedoch eine Struktur von höherer Auflösung, welche mit 2D Kristallen nur schwer zu erreichen ist. Im Verlauf der Arbeit wurden deshalb mehr als 100000 3D Kristallisationsexperimente durchgeführt, wodurch die Kristallisation von aus Erbsenblättern isoliertem und in vitro gefaltetem LHC-II gelang. Die 3D Kristalle aus nativem Material zeigten einen für die röntgenkristallographische Strukturaufklärung ausreichenden Ordnungsgrad und führten zu einer Struktur des LHC-II bei 2.5 Å Auflösung (Standfuss et al., eingereicht). Die Struktur zeigt 223 der 232 Aminosäuren und die Position und Orientierung von 4 Carotinoiden (2 Luteine, 1 Neoxanthin und 1 Violaxanthin), 14 Chlorophyllen (8 Chl a und 6 Chl b) und zwei Lipiden (PG und DGDG) pro Monomer. Diese Informationen sind essentiell für das Verständnis des Energietransfers innerhalb des LHC-II und zu den Photoreaktionszentren und sollten zusammen mit der großen Anzahl von spektroskopischen Untersuchungen eine zukünftige detaillierte Modellierung dieser ultraschnellen und extrem effizienten Energietransfer Prozesse ermöglichen. Auf Basis der Ladungsverteilung der stromalen Seite des Komplexes konnte ein Modell für die Beteiligung des LHC-II an der Stapelung von Grana in Chloroplasten erstellt werden. Dieses liefert außerdem eine plausible Erklärung für den mittels Phosphorylierung des N-Terminus gesteuerten Ausgleich von Anregungsenergie zwischen PS-I und PS-II. Die 2.5 Å Struktur des LHC-II zeigt schließlich einen einfachen aber effektiven Mechanismus zur Optimierung und Schutz des Photosyntheseapparates mittels NPQ. Dieser benötigt keine Strukturänderungen des LHC-II oder der restlichen Lichtsammelantenne und beruht auf der reversiblen Bindung der Xanthophylle Violaxanthin und Zeaxanthin an LHC-II. Diese Arbeit liefert damit Beiträge zu allen Funktionen des LHC-II Komplexes und hilft damit grundlegende Regulationsmechanismen und die Bereitstellung von solarer Energie für die pflanzliche Photosynthese zu verstehen.
• Light energy for photosynthesis is mainly collected by light harvesting systems. In plant photosynthesis these are the light-harvesting-complex I (LHC-I) and the light-harvesting-complex II (LHC-II) associated with photosystems (PS) I and II, respectively. LHC-II is the most abundant pigment-protein complex in plant chloroplasts and binds about 50% of all chlorophyll in the thylakoid membrane. The protein-pigment complex LHC-II has four distinct but related roles in plant photosynthesis. I) Optimal positioning of pigment molecules for light harvesting and transfer of excitation energy to the reaction centers. II) Separating different parts of the photosynthetic apparatus by maintaining and stabilizing thylakoid grana. III) Balancing of excitation energy flow to the reaction centers of PS-I and PS-II through a mechanism regulated by phosphorylation of the LHC-II N-terminus, IV) Prevention of photosystem overexcitation through a process called non-photochemical quenching (NPQ). LHC-II forms trimers in different combinations of three isoforms (Lhcb1, Lhcb2 and Lhcb3), of which Lhcb1 with 70-90% is the most abundant. Each monomer binds 8 different kinds of co-factors accounting for about 30% of its mass. The LHC-II isoforms are highly conserved among different species and therefore they are expected to have distinct functional roles. So far, studies of the LHC-II complex have been carried out either with LHC-II preparations isolated from plants containing all isoforms or with recombinant Lhcb1 produced in vitro from its components. A detailed understanding of the functional implications of LHC-II heterogeneity, however, depends on the availability of pure LHC-II isoforms in the amounts necessary for spectroscopic and biochemical investigations. In the first part of this thesis, all three LHC-II isoforms were produced by in vitro folding of functional complexes from bacterially expressed polypeptide, pigments and lipids. On these complexes a biochemical and spectroscopic characterization has been performed (Standfuss and Kühlbrandt 2004). Our results indicate a high degree of similarity between all isoforms. However Lhcb3 shows significant differences with respect to pigment organization, trimer formation and spectroscopic properties. It can be concluded that the main role of Lhcb1 and Lhcb2 is in the adaptation of photosynthesis to different light regimes. The most likely role of Lhcb3 is that Lhcb3-containing LHC-II trimers function as intermediaries in excitation energy transfer from the main Lhcb1/Lhcb2 antenna to the PS-II core. Electron microscopy (EM) and electron diffraction of two-dimensional (2D) crystals yielded the first atomic model of LHC-II, revealing the position of 12 chlorophylls and two carotenoids and thus providing crucial information for our present understanding of the complex. A full understanding of the LHC-II functions requires a structure at higher resolution, for which the 2D membrane crystals were not sufficiently well ordered. Therefore more then 100000 crystallization experiments were performed resulting in 3D crystals of native LHC-II isolated from pea seedlings and LHC-II folded in vitro from inclusion bodies and pigments. Crystals obtained from the native complex were sufficiently well ordered for x-ray crystallography and resulted in a LHC-II structure at 2.5 Å resolution (Standfuss et al., submitted). The structure shows 223 of the 232 aminoacids and the position and orientation of 4 carotenoids (2 luteins, 1 neoxanthin and 1 violaxanthin), 14 chlorophylls (8 Chl a and 6 Chl b) and two lipids (PG and DGDG) per monomer. In combination with available spectroscopic data this information will allow a detailed understanding of the ultrafast and extremely efficient energy transfer inside LHC-II and from the complex to the photosystems. Based on the charge distribution on the stromal side of LHC-II a model for grana membrane appression could be proposed. This model furthermore explains how phosphorylation of the LHC-II N-terminus can control the distribution of excitation energy between PS-II and PS-I. Finally the structure suggests an easy but effective mechanism for optimizing and protecting the photosynthetic apparatus via non-photochemical quenching (NPQ). This NPQ mechanism does not involve structural changes of LHC-II nor the remaining Light-harvesting antennae and is based on the reversible binding of the xanthophylls violaxanthin and zeaxanthin to the LHC-II complex. This thesis therefore contributes significantly to our knowledge of all known functions of LHC-II and helps to understand fundamental regulation mechanisms and the supply of solar energy for plant photosynthesis.