Open Access

Julia-Alexandra Adams

• Die natürliche Killerzelllinie NK-92 zeichnet sich durch eine breit gefächerte Aktivität gegen verschiedenste Tumore und Leukämien aus und würde sich daher prinzipiell für eine Verwendung als adoptives Zelltherapeutikum eignen. NK-92-Zellen sind eine von nur 5 etablierten NK-Zelllinien weltweit. Ihr Wachstum in der Zellkultur war bisher von Bedingungen abhängig, die mit einer klinischen Anwendung der Zellen nicht zu vereinbaren sind. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es daher, ein Kulturverfahren zu etablieren, mit dem sich NK-92-Zellen unter Bedingungen einer „Guten Herstellungs Praxis“ kultivieren und expandieren lassen. In dieser Arbeit wurde daher die Adaption der NK-92-Zellen an ein in der Klinik einsetzbares Zellkulturmedium vorgenommen und ein Batch-Kulturverfahren entwickelt, mit dem sich die NK-92-Zellen innerhalb von 10-14 Tagen auf bis zu 1010 Zellen in 10L Kulturvolumen expandieren lassen. Die Funktionsprüfung der NK-92-Zellen, anhand der Expression von immunologisch relevanten Oberflächenrezeptoren (CD11a, CD25, CD28, CD54, CD56, CD122, FAS-L), ergab keine Veränderung des Phänotyps der expandierten Zellen. Darüber hinaus wiesen die Zellen eine Viabilität von >95,3% +/- 0,46% auf, und ihre zytotoxische Aktivität gegen die NK-sensitive Leukämiezelllinie K562 war nicht eingeschränkt. Da NK-92-Zellen in der Erkennung virusinfizierter und maligner Zellen nicht MHCrestringiert sind, eignen sie sich auch für den ungerichteten Einsatz. Hierzu wäre eine Expansion der Zellen im großen Massstab mit anschliessender Kryokonservierung von Vorteil, da die Zellen dann im Voraus hergestellt und geprüft werden könnten. Die Prüfung des Einflusses unterschiedlicher Konzentrationen (0, 0,5, 1, 2, 3, 5, 8 10 %) der Einfrierschutzlösung Dimethylhylsulfoxid (DMSO) auf die zytotoxische Aktivität der NK-92-Zellen ergab keine Einschränkung der NKZellfunktion bei Konzentrationen < 5%. Es wurden daraufhin verschiedene Einfrierprotokolle und deren Einfluss auf die Viabilität der NK-92-Zellen untersucht. NK-92- Zellen wurden mit 2, 3, 5 8 und 10% DMSO in humanem Serum Albumin (HSA) in Ampullen, oder aber im klinischen Masstab (5x108 Zellen/ 20ml HSA) mit 3, 5 und 10% DMSO eingefroren und ihre Viabilität nach dem Auftauen untersucht. Im Mittel ergab sich für alle Zellpräparationen und DMSO Konzentrationen eine relativ geringe Viabilität der Zellen nach dem Auftauen (<50% +/- 9,77). Hierbei war es unerheblich, ob die für eine klinische Anwendung der allogenen NK-92-Zellen notwendige Bestrahlung mit 10GY vor dem Einfrieren oder nach dem Auftauen durchgeführt wurde (Viabilität 48,8% versus 44%). Aus den in dieser Dissertation erarbeiteten Daten wurde schliesslich ein Konzept zur Expansion der NK-92-Zellen entwickelt, welches ihren klinischen Einsatz, unter Erhalt der Funktionalität bei höchstmöglicher Sicherheit für den Patienten, erlaubt. Dieses Konzept geht von einer Expansion der NK-92-Zellen, ausgehend von einer Masterzellbank, in 2L Batchkulturen im Nunc-Wannenstapel-System aus. Die Kulturen werden mit 2x104 NK-92-Zellen/ml X-Vivo 10 Medium, 5% hitzeinaktiviertem humanen Plasma und 100IE IL-2 beimpft. Nach 10 Tagen haben die Kulturen ihre höchste Dichte (6,4 x105/ml) erreicht.
• The natural killer-cell line NK-92 is characterized by a broad activity against different leukaemias and solid tumors and would therefore, in principle, be suitable to be used as an adoptive anticancer cellular therapeutic. NK-92 cells are one out of only 5 worldwide established NK cell lines. However, their expansion in cell culture was, until now, dependent on conditions that are not in compliance with the standards for good manufactury practice as necessary for clinical use. Therefore, the goal of thesis was to establish a culture method that allows the culture and expansion of the NK-92 cells under conditions compliant with the standards of "good manufactury practice, GMP". In this work, NK-92 cells were adapted to a cell culture medium that is suitable for clinical use. Moreover, based on a “Batch-culture” method an expansion protocol was developed that allows the harvest of up to 1010 cells in 10L culture volume within 10-14 days of expansion. The functional characterization of expanded NK-92 cells showed no changes in the expression pattern of relevant immunological surface receptors (CD11a, CD25, CD28, CD54, CD56, CD122, FAS-L). In addition, the cells showed very good viability >95,3% +/- 0,46%, and no impairement with regard to their cytotoxic activity against the NK-sensitive leukemia cell line K562. Since the immune response of NK cells against virus infected or malignant cells is not MHC-restricted, they thus hold the option for a readily available “off the shelf” anti-cancer cell therapy. For this, an expansion of the cells on a large scale basis with concomitant cryoconservation would be of advantage and allow the in advance production of NK-92 batches with defined quality. The examination of the influence of different concentrations (0, 0,5, 1, 2, 3, 5, 8 10 %) of the freezing solution Dimethylhylsulfoxid (DMSO) on the cytotoxic activity of the NK-92 cells, revealed that concentrations of <5% had no impact on the NK cell function. As a result, different freezing protocols were examined with regard to their influence on the viability of NK-92 cells. The NK-92 cells were cryopreserved in cryovials with 2, 3, 5, 8 and 10% DMSO in human serum albumin (HSA), respectively. Clinical scale doses of NK-92 (5x108 cells/20ml HSA) were cryopreserved in freezing bags with 3, 5 and 10% DMSO, respectively. After thawing NK-92 cells were tested for their viability. Overall, the cryopreservation and thawing of NK-92 cells resulted in considerably low viabilities irrespective of freezing protocol and/or DMSO concentration used, with mean viabilities of < 50% +/- 9,77. For a clinical application, NK-92 cells have to be irradiated with 10 Gy. It was of no significance for the viability of cryopreserved NK-92 cells, whether the irradiation was performed before freezing or after thawing (Viability 48,8% vs. 44%). Based on this thesis, a concept was developed that allows the expansion of NK-92 cells to clinical scale, resulting in functional highly active NK-92, while providing outmost safety standards for the patients. Starting from a master cell bank, this concept assumes the expansion of NK-92 cells in 2L Nunc-CellfactoryÒ culture flasks under batch culture conditions. The cultures are initiated with 2x104 NK-92 cells/ml in X-Vivo10 Medium, supplemeted with 5% fresh frozen plasma (FFP) and 100 IE IL-2. On day 10 the batch cultures have reached their maximum density (6,4 x105/ml ).