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Christian Klein

• Monoklonale Antikörper sind seit vielen Jahren aus den biochemischen und molekularbiologischen Laboratorien nicht mehr wegzudenken. Sowohl in der Grundlagenforschung, als auch in der angewandten medizinischen Diagnostik und der Therapie spielen sie eine immer wichtigere Rolle. Dennoch konnten sich monoklonale Antikörper als Hilfsmittel im Bereich der Naturstoffanalytik bisher noch nicht durchsetzen. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand daher die Frage, inwieweit sich monoklonale Antikörper und rekombinante Antikörperfragmente für die Analytik komplexer Naturstoffgemische eignen. Eine der Zielstrukturen, gegen die monoklonale Antikörper generiert werden sollten, ist das pentazyklische Triterpen Oleanolsäure. Oleanolsäure ist als Aglykon in zahlreichen verschiedenen Triterpensaponinen enthalten. Triterpensaponine bzw. Triterpensaponin-haltige Arzneipflanzen spielen aufgrund ihres breiten Wirkungsspektrums in der Phytotherapie eine wichtige Rolle. Sie zeichnen sich nachweislich durch venentonisierende, antiödematöse, antiphlogistische, diuretische, expektorierende und broncholytische Eigenschaften aus. Da es sich bei den Triterpensaponinen um eine sehr heterogene Stoffgruppe handelt, ist ihre Analytik sehr aufwendig. Monoklonale Antikörper könnten daher bei der Analytik von komplexen Saponingemischen sehr nützlich sein. In Zusammenarbeit mit Frau Dr. Kerstin Brand aus dem Arbeitskreis von PD Dr. Werner Knöss (Universität Bonn) konnten verschiedene monoklonale Antikörper gegen Oleanolsäure etabliert werden. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Bindungseigenschaften dieser Antikörper eingehend charakterisiert. In kompetitiven ELISAs konnten die Molekülepitope, an die die verschiedenen Antikörper binden, bestimmt werden. Außerdem wurden die Immunglobuline auf Kreuzreaktivitäten gegenüber 72 unterschiedlichen sekundären Arzneipflanzenmetaboliten untersucht. Die monoklonalen Antikörper zeigten dabei keine Interaktion mit Steroiden, Phytosterolen und Herzglykosiden – Substanzen die zwar in die Gruppe der Triterpene eingeordnet werden können, sich aber in ihrer Struktur und Stereochemie deutlich von der Oleanolsäure unterscheiden. Gegenüber zahlreichen pentazyklischen Triterpenen, die strukturelle Ähnlichkeiten mit der Oleanolsäure besitzen, zeigten hingegen alle untersuchten Immunglobuline eine ausgeprägte Kreuzreaktivität. Daher eignen sie sich für die Analytik von komplex zusammengesetzten Triterpengemischen, z.B. von Arzneipflanzenextrakten. Dies konnte durch verschiedene direkte und indirekte Kompetitionsversuche mit unterschiedlichen Arzneipflanzenextrakten im Rahmen dieser Arbeit und der Dissertation von Frau Dr. Kerstin Brand gezeigt werden. Mit Hilfe eines kompetitiven ELISAs ist z.B. ein Screening von unbekannten Arzneipflanzen auf Triterpensaponine möglich. Auch eine Wertbestimmung von Arzneipflanzen oder Arzneipflanzenextrakten mit Hilfe der monoklonalen Antikörper ist denkbar, sofern eine Referenz zur Verfügung steht, auf den die Kompetitionsergebnisse bezogen werden können. Der Einsatz der hier vorgestellten Antikörper wird allerdings dadurch eingeschränkt, dass die Immunglobuline eine unvorhersehbare Polyspezifität gegenüber den polyphenolischen Sekundärmetaboliten Quercetin und Ellagsäure zeigten. Bei einem Einsatz der Antikörper im Rahmen der Naturstoffanalytik sind daher Vorversuche erforderlich, um diese Substanzen zu identifizieren und wenn möglich zu entfernen. Einer der untersuchten monoklonalen Antikörper, der Antikörper der Zelllinie 10F10, zeigte eine Kreuzreaktivität gegenüber verschiedenen ß-Boswelliasäuren. Boswelliasäuren sind in der Lage, das Enzym 5-Lipoxygenase zu hemmen und dadurch die Synthese von entzündungsfördernden Leukotrienen zu inhibieren. Daher scheinen Boswelliasäuren viel versprechende Arzneistoffe bei der Therapie der unterschiedlichsten inflammatorischen Erkrankungen, wie z.B. Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, Asthma bronchiale oder rheumatoider Arthritis zu sein. Der Antikörper der Zelllinie 10F10 soll im Arbeitskreis von Prof. Dieter Steinhilber am Institut für Pharmazeutische Chemie der Universität Frankfurt unter anderem für eine Immobilisierung der Boswelliasäuren an Immunaffinitätssäulen eingesetzt werden. In diesem Arbeitskreis wird der Einfluss von ß-Boswelliasäuren auf die 5-Lipoxygenase intensiv erforscht. In einem zweiten Projekt wurden rekombinante scFv-Antikörperfragmente gegen das Triterpen Oleanolsäure und gegen das Pyrrolizidinalkaloid Retrorsin generiert. Pyrrolizidinalkaloide sind hepatotoxische Sekundärmetabolite, die in zahlreichen Nutzpflanzen und traditionellen Arzneipflanzen enthalten sind. Insgesamt wurden vier verschiedene scFv-Fragmente konstruiert. Zwei Anti- Oleanolsäure-Antikörperfragmente konnten in E. coli erfolgreich periplasmatisch exprimiert und ihre Funktionalität in verschiedenen Antigenbindungsstudien nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde eine Phagen-Display- und Phagen- Panning-Methode etabliert, mit deren Hilfe es möglich ist, gezielt nach funktionellen Antikörperfragmenten zu suchen. Mit dieser Methode sollte es möglich sein, nach erfolgter Mutation der verschiedenen scFv-Fragmente, Proteine mit neuen Bindungseigenschaften zu identifizieren. Interessant wären dabei z.B. scFv- Fragmente, die mit Pyrrolizidin-N-oxiden interagieren. Gegen diese Substanzen konnten im Arbeitskreis Dingermann mit Hilfe der konventionellen Hybridoma- Technologie bisher noch keine monoklonalen Antikörper generiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass es sich bei monoklonalen Antikörpern und rekombinanten Antikörperfragmenten um interessante Hilfsstoffe für die Naturstoffanalytik handelt, deren Bedeutung für dieses Anwendungsgebiet aber bisher noch deutlich unterbewertet ist. Es wäre daher sehr interessant, die hier vorgestellten Projekte fortzuführen und die Arbeitsmethoden weiter zu optimieren. Mit den im Rahmen dieser Arbeit charakterisierten Anti-Oleanolsäure-Antikörpern stehen bereits drei Immunglobuline für die Arzneipflanzenanalytik zur Verfügung. Von allen drei Antikörpern liegen inzwischen auch scFv-Fragmente vor. Diese Fragmente könnten modifiziert und mit Hilfe der hier vorgestellten Phagen-Display-Methode nach Proteinen mit modifizierten Bindungseigenschaften gesucht werden. Letztendlich wäre auf diese Weise die Generierung eines großen Sortiments von Antikörpern und Antikörperfragmenten für die Analytik der unterschiedlichsten Substanzklassen möglich.