Open Access

Sandra Gendreau

• Reliable communication in the central nervous system requires the precise control of the duration and the intensity of neurotransmitter action at specific molecular targets. After their release at the synapse, neurotransmitters activate pre- and/or postsynaptic receptors. To terminate synaptic transmission, neurotransmitters are in turn inactivated by either enzymatic degradation or active uptake into neuronal and/or glial cells by neurotransmitter transporters. In the present study, two types of membrane proteins involved in transcellular signal transduction were investigated, the P2X receptors, which are ATP-gated ion channels and the glutamate transporters of the EAAT family. The first part of this study is concerned with the targeting and anchoring of P2X receptors at specific locations. P2X receptors play a role of fast excitatory neurotransmission to extracellular ATP in both the peripheral and central nervous system. For several ligand-gated ion channel, like glycine receptors or nicotinic acetylcholine receptors, it is known that specific binding proteins exist, which are involved in receptor trafficking and anchoring of the receptors at appropriate sites on the synapse. Within the P2X family, amino acid homology is scattered over the protein sequence excepted of the cytoplasmic C-terminal tails, which do not share significant sequence similarity, indicating that they might provide peculiar properties to the respective receptor isoforms. Using GST fusion proteins containing the C terminal end of the P2X2A, P2X5 and P2X7 subunits as baits, ßIII tubulin was identified by MALDI-TOF mass spectrometry as a direct interacting partner of P2X2A. ßIII tubulin did not interact with P2X5 nor with P2X7. The tubulin binding motif of P2X2A could be confined to a 42 amino acid long region ranging from amino acid 371 to 412 of the complete P2X2A subunit. This domain, which includes a total of six serine residues and twelve proline residues, interestingly overlaps to a significant extent with a 69 amino acid long sequence, which is lacking in P2X2B, a splice variant of P2X2A. P2X2B receptors are known to desensitize - significantly faster than P2X2A receptors. The interaction of the P2X2A receptor with ßIII tubulin may contribute to receptor desensitization as well as tethering of the P2X2A receptor at specialized regions of the cell. In a second part of this work, the oligomeric state of two distantly related glutamate transporters, the human glial glutamate transporter hEAAT2, and the glutamate transporter ecgltP of E.coli was determined. Excitatory amino acid transporters (EAATs) buffer and remove synaptically released L-glutamate and maintain its concentration below neurotoxic levels. Mammalian glutamate transporter subunits are known to form homomultimers, but controversial numbers of subunits per transporter complex have been reported, ranging from 2-5. Both hEAAT2 and ecgltP proteins expressed at high levels in Xenopus laevis oocytes, from which they were purified in a [35S]methionine-labeled form under nondenaturing conditions by metal affinity chromatography. Blue native PAGE analysis revealed that both the hEAAT2 and ecgltP transporters exist exclusively as homogenous populations of homotrimers in Xenopus oocytes. The trimeric structure was corroborated by chemical crosslinking. Also, ecgltP purified as a recombinant protein from its natural host E.coli migrated as a trimeric protein on blue native PAGE gels. The conservation of the quaternary structure from prokaryotes to mammals assigns an important functional role to the trimeric structure. Glutamate transporters are known to exhibit a dual mode of operation by functioning both as glutamate Na+/K+/H+ co-transporters and as anion channels. It is intriguing to speculate that the EAAT monomer is responsible for the secondary active transport of glutamate, whereas a barrel-like arrangement of the three subunits forms a central anion pore mediating anion conductivity.
• Nach ihrer Freisetzung in den synaptischen Spalt aktivieren Neurotransmitter prä- und postsynaptische Rezeptoren. Um die synaptische Erregungsübertragung zu beenden, werden Neurotransmitter entweder enzymatisch abgebaut oder Transporter-vermittelt zurück in die präsynaptische Nervenendigung und/oder in Glial-Zellen aufgenommen. In der vorliegenden Studie wurden zwei Membranprotein-Typen, die beide bei der transzellulären Signaltansduktion beteiligt sind, untersucht, (i) als P2X-Rezeptoren bezeichnete ATP-gesteuerte Ionenkanäle und (ii) Glutamattransporter aus der EAAT-Familie. Der erste Teil dieser Studie befasst sich mit der biochemischen Suche nach Proteinen, die mit P2X-Rezeptoren interagieren. P2X-Rezeptoren spielen u.a. eine wichtige Rolle bei der schnellen neuronalen Erregungsüberübertragung. Für mehrere Ligand-gesteuerte Ionenkanäle wie Glycin-Rezeptoren und nikotinische Acetylcholin-Rezeptoren wurden spezifische Bindungsproteine identifiziert, die dem „intrazellulären Trafficking“ sowie der Verankerung an der Synapse dienen. Um zu untersuchen, ob ähnliche spezifische Bindeproteine auch für P2X-Rezeptoren vorkommen, wurden GST-Fusionsproteine, die die intrazellulären C-terminalen Domänen von P2X2-, P2X5- und P2X7-Untereinheiten beinhalten, als Köder eingesetzt, um interagierende Proteine aus Detergenzextrakt von Rattengehirnen zu „fischen“. Auf diese Weise wurde ßIII-Tubulin durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie als direkte Interaktionspartner der P2X2-Untereinheit identifiziert. ßIII-Tubulin interagiert weder mit P2X5 noch mit P2X7. Das Tubulin-Bindungsmotiv der P2X2-Untereinheit konnte auf eine 42 Aminosäure lange Region eingeschränkt werden. Diese Domäne, die insgesamt sechs Serinreste sowie zwölf Prolinreste enthält, überlappt interessanterweise weitgehend mit einer 69 Aminosäuren langen Sequenz, die der P2X2B-Untereinheit - einer Splice-Variante der P2X2-Untereinheit - fehlt. Die Interaktion zwischen P2X2-Rezeptoren und ßIII-Tubulin könnte sowohl für die Rezeptor-Desensibilisierung als auch für die subzelluläre Lokalisierung von P2X2-Rezeptoren von Bedeutung sein. In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Quartärstruktur zweier entfernt verwandter Glutamattransporter, dem humanem Glutamattransporter hEAAT2 und dem E. coli-Glutamattransporter ecgltP bestimmt. Plasmamembranständige Transporter für exzitatorische Aminosäuren (EAATs, excitatory amino acid transporters) puffern die subsynaptische Glutamatkonzentration ab und halten sie unter dem neurotoxischen Spiegel. Von Säugetier-Glutamattransporter-Untereinheiten ist bekannt, dass sie Homomultimere ausbilden, die genaue Anzahl an Untereinheiten pro Transporter ist jedoch umstritten. Blaue native PAGE-Analyse der aus Xenopus-Oocyten durch Ni2+-NTA-Chromatografie gereinigten Transporterproteine hEAAT2 und ecgltP ergab, dass beide als homogene Population von Homotrimeren in Xenopus-Oozyten vorliegen. Die trimere Struktur wurde durch chemische Quervernetzung bestätigt. Die evolutionäre Konservierung der trimeren Struktur der Glutamattransporter ist ein starker Hinweis darauf, dass der Quartärstruktur eine wichtige funktionelle Rolle zukommt. Glutamattransporter fungieren sowohl als Transporter als auch als Anionenkanäle, indem sie neben dem an den Glutamattransport gekoppelten elektrogenen Ionenflux auch eine Anionen-Leitfähigkeit vermitteln, der vom Glutamattransport thermodynamisch abgekoppelt ist. Es ist vorgeschlagen worden, dass die Anionen-Leitfähigkeit der Dämpfung der neuronalen Erregbarkeit dient. Möglicherweise steht die Anionenkanal-Funktion in direkten Zusammenhang mit der trimeren Struktur, die dazu dienen könnte, durch ringförmige Anordnung bestimmter Transmembrandomänen jeder der drei Untereinheiten eine Ionenkanal-ähnliche zentrale Ionenpore zu schaffen.