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Zusammenfassung:
Ras-Proteine gehören zu einer Familie von Proto-Onkogenen, die für kleine GTPasen kodieren. Sie sind an vielen zellulären Prozessen wie Zellteilung, Apoptose und Differenzierung beteiligt. In 20-30% aller menschlichen Tumore weisen die RAS-Gene Punktmutationen auf, die das Protein in einen konstitutiv aktiven Zustand versetzen. Aus einer retrospektiven Studie von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (CALGB 8525) ist hervorgegangen, dass es eine Korrelation zwischen RAS-Status und Rezidivrate nach hochdosierter Cytarabin-Behandlung gibt. Patienten mit mutiertem RAS und Hochdosis-Cytarabin Behandlung, entwickelten signifikant weniger häufig Rezidive als Patienten mit wildtyp RAS oder Patienten, die mit Niedrigdosis-Cytarabin behandelt wurden. Somit geht aus der Studie hervor, dass die Expression eines Onkogens in Tumorzellen positive Auswirkungen auf die Behandlung mit Chemotherapeutika haben kann. Ausgehend von dieser Beobachtung sollte in dieser Arbeit der Effekt von onkogenem RAS in einem Zellsystem in vitro studiert und die molekularen Mechanismen aufgeklärt werden. Um onkogenes Ras in einem Zellsystem zu untersuchen, das als Model für akute myeloische Leukämie herangezogen werden kann, wurden hämatopoetische Zellen der Maus, die mit dem onkogenen Fusionsprotein MLL-ENL immortalisiert wurden, verwendet. Das Fusionsonkoprotein MLL-ENL kommt ausschließlich in Leukämien vor und die Zellen zeigen einen myeloischen Phänotyp. Diese Zellen wurden mit einem Kontrollvektor bzw. mit einem Vektor, der onkogenes RASV12 exprimiert, infiziert und auf die Behandlung mit Chemotherapeutika, insbesondere Cytarabin, untersucht. Die zytotoxische Wirkung von Cytarabin beruht darauf, dass die Substanz das Fortschreiten der Replikationsgabel behindert, woraufhin eine NASchadenssignalkaskade aktiviert wird, die nachfolgend Zellzyklusarrest oder Apoptose vermittelt. Cytarabin wirkt somit hauptsächlich auf Zellen, die sich in der Replikationsphase befinden. In Suspension wiesen die RAS-infizierten Zellen auf die Behandlung mit Cytarabin keinen Unterschied zu den Kontroll-Zellen hinsichtlich Zellzahl, Zellzyklus und Apoptose auf. Erfolgte die Kultivierung jedoch in semisolidem Medium, um die Klonogenität der Zellen zu untersuchen, zeigten die RAS-infizierten Zellen nach der Behandlung mit Cytarabin, Etoposid und Daunorubicin, eine starke Einschränkung in der Koloniebildung. Um die Ursache festzustellen, wodurch die klonogenen Zellen eliminiert werden, wurden die Zellen hinsichtlich Apoptose, Seneszenz und Differenzierung untersucht. Expressions- und Durchflusszytometrie-Analysen von Apoptosemarkern belegen, dass die Induktion von Apoptose in den RAS-infizierten Zellen niedriger war als in den Kontroll-Zellen und Apoptose damit nicht als Ursache für die eingeschränkte Klonogenität herangezogen werden kann. Aus der Literatur ist bekannt, dass die Infektion von primären Zellen mit onkogenem Ras eine DNA-Schadensantwort aktiviert, die einen seneszenten Phänotyp auslöst. Seneszente Zellen zeichnen sich durch eine erhöhte Expression von p53, p21Cip1 und des Ink4/Arf Locus (mit den Tumor Suppressoren p16Ink4a, p19Arf und p15Ink4b) aus. Zudem exprimieren seneszente Zellen das Enzym SA-β-Galaktosidase, dessen Aktivität in den Zellen sichtbar gemacht werden kann. Die Untersuchung der Kontrollproteine Chk1, H2A.x und ATM ergab, dass die DNASchadensantwort nur in den RAS-infizierten Zellen aktiviert war und diese durch Cytarabin weiter verstärkt wurde. Die Proteine p53, p21Cip1, p16Ink4a, p19Arf und p15Ink4b wurden in den RAS-infizierten Zellen stärker exprimiert als in den Kontroll-Zellen und durch Cytarabin teilweise weiter induziert (p53 und p21Cip1). Dagegen wurde das Enzym SA-β-Galaktosidase, sowohl in Kontroll-Zellen als auch in RAS-infizierten Zellen durch die Behandlung mit Cytarabin gleichermaßen aktiviert, was einen Hinweis darauf gibt, dass Cytarabin in Kontroll-Zellen Seneszenz auslösen kann. Die oben genannten Proteine sind auch in differenzierten Zellen stärker exprimiert. Ferner löst onkogenes Ras in hämatopoetischen Zellen Differenzierung aus, was im Übrigen auch für Cytarabin gezeigt wurde. Expressions- und Durchflusszytometrie-Analysen der Differenzierungsmarker ly6g (Gr1) und itgam (Mac1) zeigen, dass RAS-infizierte Zellen stärker differenziert waren als Kontroll-Zellen und die Behandlung mit Cytarabin die Differenzierung weiter verstärkte. Dies wurde auch anhand der Morphologie der Zellen bestätigt. Entscheidend für die Induktion der Differenzierung war dabei die Aktivierung der DNASchadenssignalkaskade, was durch die zusätzliche Behandlung der Zellen mit dem ATM/R-Inhibitor Koffein belegt werden konnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass konventionelle Zytostatika einen weiteren Mechanismus zur Tumorbekämpfung aktivieren können: Differenzierung. Differenzierung als therapeutischer Ansatz findet bereits in der Behandlung der akuten Promyelozyten Leukämie Anwendung. Die Induktion der Differenzierung könnte vor allem für Tumor-initiierende Zellen von größtem Interesse sein. Diese Krebsstammzellen werden durch herkömmliche Chemotherapeutika oft nicht vollständig eliminiert und können somit Ursache für Rezidive sein. Die Entwicklung von Substanzen, die die Differenzierung dieser Zellen aktivieren, wäre ein wichtiger Schritt der Resistenz vieler Tumorzellen gegenüber Chemotherapeutika entgegenzuwirken.

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