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Titel:In vivo-Untersuchungen von Konformations-Änderungen der Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Nicotiana tabacum
Autor:Freymark, Gerald
Weitere Beteiligte: Bölker, Michael (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2005
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2006/0064
DOI: https://doi.org/10.17192/z2006.0064
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2006-00640
DDC:570 Biowissenschaften, Biologie
Titel (trans.):In vivo-Analyses of Conformational Changes of the Calcium Dependent Protein Kinase NtCDPK2 from Nicotiana tabacum
Publikationsdatum:2006-01-30
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
CDPK, Bimolecular Fluorescence Complementation, Ubiquitin, Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer, Protein-Serin-Threonin-Kinasen, Split Ubiquitin, Calcium Dependent Protein Kinase, Calcium, Konformationsänderung

Zusammenfassung:
Ziel dieser Arbeit war die Detektion von Konformations-Änderungen der Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Tabak (Nicotiana tabacum), die in Abhängigkeit eines Stress-Stimulus induziert werden. Da bislang weder Röntgen- noch NMR-Strukturen für ein Gesamt-Protein einer CDPK bekannt sind, sollten mit verschiedenen in vivo-Methoden Hinweise auf den biochemischen Reaktions-Mechanismus gesammelt werden. Hierzu wurden zum einen intermolekulare Interaktionen einzelner CDPK-Domänen mit dem bereits in Hefe etablierten Split-Ubiquitin (SplitUB) System in trans untersucht. Zum anderen wurde das System auch für eine durch Agrobacterium tumefaciens vermittelte, transiente Expression in der Tabak-Art Nicotiana benthamiana weiterentwickelt und erfolgreich angewandt. Dabei konnte eine Interaktion der Calmodulin-ähnlichen Domäne (CLD) mit der autoinhibitorischen Junction-Domäne (J) der CDPK nachgewiesen werden. Auch das System der "Bimolecular Fluorescence Complementation" wurde für die transiente Expression in N. benthamiana weiterentwickelt und konnte Interaktionen der N-terminalen Domänen (VKJ) mit der CLD nachweisen. Aufgrund stärkerer Hintergrund-Fluoreszenz konnte diese Methode nur Hinweise auf eine mögliche Stimulus-Abhängigkeit der Interaktionen liefern. Neben den intermolekularen Wechselwirkungen wurden auch intramolekulare Interaktionen und somit die Gesamt-Konformation von Proteinen analysiert. Die hierzu verwendete Methode des "Fluorescence Resonance Energy Transfer" (FRET) in cis konnte eine Abhängigkeit der Konformation von der Struktur der Junction-Domäne in planta nachweisen. Zudem wurde das SplitUB-System in cis für die Anwendung in Pflanze weiterentwickelt. Hiermit konnte durch Analysen mutierter Formen von NtCDPK2 eine Abhängigkeit der Konformation von einer biologischen Funktionalität sowohl der Kinase-Domäne als auch von J aufgezeigt werden. Ebenso spielte die Calcium-Affinität der in der CLD lokalisierten EF-Hände eine zentrale Rolle. Diese Ergebnisse vervollständigten ein in der Literatur diskutiertes Aktivierungs-Modell für CDPKs. Aufgrund einer hohen Hintergrund-Abspaltung des Reporters konnten jedoch keine Aussagen über schnelle, dynamische Prozesse wie z.B. nach einer Stimulus-induzierten, transienten Aktivierung des Enzyms getroffen werden. Das SplitUB-System wurde auch für Untersuchungen von Licht-abhängigen Konformations-Änderungen am Beispiel des Cryptochroms AtCRY2 aus Arabidopsis thaliana angewandt. Dieser UV-A- und Blaulicht-Rezeptor ließ einen eindeutigeren Nachweis erwarten, da eine konstante Aktivierung des Enzyms durch Lichteinstrahlung postuliert wird. Es konnte in dieser Arbeit erstmals die Licht-abhängige Konformations-Änderung eines Cryptochroms in vivo nachgewiesen werden. Das SplitUB-System erlaubte es hierbei im Gegensatz zu Untersuchungen an NtCDPK2, auch reziproke und dynamische Unterschiede nach Übergang in Dauerlicht- oder Dauerdunkel-Bedingungen zu detektieren.


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