Engineering redox metabolism of Pseudomonas putida KT2440

Zobel, Sebastian; Büchs, Jochen; Blank, Lars Mathias

doi:urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-109244

Engineering redox metabolism of Pseudomonas putida KT2440 = Engineering des Redox Metabolismus von Pseudomonas putida KT2440

Zobel, Sebastian

2016 & 2017

VerantwortlichkeitsangabeSebastian Zobel

Ausgabe1. Auflage

ImpressumAachen : Apprimus Verlag 2016

Umfang1 Online-Ressource (XII, 99 Seiten) : Diagramme

ReiheApplied microbiology ; 4

Dissertation, RWTH Aachen University, 2016

Druckausgabe: 2016. - Auch veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2017

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Blank, Lars Mathias (Thesis advisor)^RWTH* ; Büchs, Jochen (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-06-09

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-109244
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/679116/files/679116.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/679116/files/679116.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Pseudomonas putida KT2440 (frei) ; NADH (frei) ; Redox Metabolismus (frei) ; Mikrobiologie (frei) ; Molkularbiologie (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Das bekannte Bodenbakterium Pseudomonas putida gewinnt größer werdendes Interesse für eine Anwendung in der industriellen Biotechnologie. Trotz seiner bemerkenswerten natürlichen Fähigkeiten muss dieser Organismus für eine industrielle Anwendung optimiert werden, um Anforderungen industrieller Prozesse, wie bspw. das Aufrechterhalten einer homogenen katalytischen Aktivität und einer effizienten Versorgung mit Reduktionsäquivalenten, zu genügen. Aufgrund dieser Hürden bestand das Ziel dieser Arbeit i) sowohl in der Entwicklung eines genetischen Werkzeugs, das die Expressionsvariabilität minimiert als auch ii) in der Steigerung der NADH Regenrationsrate mit dem Ziel eines überproduzierenden Stammes, der für den Einsatz in der Redox Biokatalyse geeignet ist.Um das erste Ziel zu erreichen, wurde ein genetisches Element entwickelt, das in eine definierte und nur einmal existierende Stelle im Genom integriert und so Schwankungen der Kopieanzahl klassischer Vektorsysteme umgeht. Das Hauptelement dieses Werkzeugs besteht aus einem synthetischen Promoter, der über ein Verbindungsstück an das zu exprimierende Gen gekoppelt ist. Hierbei bestimmt nur der synthetische Promoter die Expressionsstärke. Die Zuverlässigkeit dieses Werkzeuges wurde anhand von Fluoreszenzmessungen mit genomisch integrierten Konstrukten mit sich im Wachstum befindenden P. putida KT2440 Kulturen nachgewiesen. So konnte eine kalibrierte Bibliothek synthetischer Promotoren entwickelt werden, deren Aktivitäten sich um das bis zu 30-fache unterscheiden. Das modulare Baukastensystem ermöglicht einfaches Austauschen des zu exprimierenden Gens. Das Werkzeug ist für einen breiten mikrobiologischen Einsatz konzipiert. Das zweite Ziel wurde auf unterschiedliche Weise verfolgt. Da im zentralen Kohlenstoffwechselweg das meiste NADH regeneriert wird, wurde versucht, über eine erhöhte Glukoseaufnahmerate eine erhöhte NADH Regenerationsrate zu erzielen. In E. coli wurde gezeigt, dass der Bedarf an ATP die Glukoseaufnahmerate kontrolliert. Daher wurde eine ATP verschwendende Reaktion in P. putida integriert, die, wahrscheinlich aufgrund von Regulationsmechanismen, nicht zu einer erhöhten Glukoseaufnahmerate führte. Das Ziel einer erhöhten NADH Regenerationsrate wurde dennoch über einen zweiten Ansatz erreicht. Hierbei wurde gezeigt, dass Formiat von P. putida KT2440 über eine NAD+-abhängige Formiatdehydrogenase zu CO2 und NADH oxidiert wird. In einer Co-Verstoffwechslung mit Glukose konnte so zusätzliches NADH bereitgestellt werden, das zu einer erhöhten Biomasseausbeute auf Glukose führte. Dieser vielversprechende Ansatz könnte die Redox Biokatalyse mit P. putida unter prozessrelevanten Bedingungen unterstützen. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein einfach durchzuführender Ganzzell-Assay entwickelt, der das Screening von Cosubstraten ermöglicht, die eine erhöhte NADH Regenerationsrate verursachen.Durch die Entwicklung eines zuverlässigen Expressionswerkzeugs und die gut beschriebene Nutzung von Formiat als Donor von Elektronen zur Erhöhung der NADH Regenerationsrate tragen die Ergebnisse dieser Arbeit zur Entwicklung von P. putida KT2440 als Platformwirt der industriellen Biotechnologie bei.

Pseudomonas putida is a remarkable soil microorganism and emerges as biotechnological platform host, which despite its remarkable natural abilities needs to be optimized to meet the challenges associated with industrial processes, e.g., homogenic behavior of a producing culture and an efficient supply of reducing equivalents. The overall goal of this thesis was twofold, i) the development of a genetic tool, which minimizes expression variability leading to a consistent phenotype of P. putida and ii) increasing the NADH regeneration rate leading to hyper producing strain suited for redox biocatalysis. The heterologous expression device was designed in a way that it integrates into a single site of the chromosome circumventing copy number variations of classical plasmid based devices. It is composed of a synthetic promoter, a translational coupler and a gene of interest. The synthetic promoter is hence the only sequence determining the strength of gene expression. The reliability of this device was demonstrated by fluorescence measurements with genomically integrated constructs exhibiting a stable expression during the main stage of growth. By this means a calibrated synthetic promoter library was developed exhibiting a 30-fold range of activities. The modular structure of the heterologous expression device allows simple exchange of the gene of interest and hence a community tool is presented.The aim of increasing the NADH regeneration rate was pursued by two different approaches. Since the central carbon metabolism is the main source of NADH, the first approach aimed at increasing the glucose uptake rate, which in E. coli was shown to be controlled by the demand for ATP. However, this strategy adapted to P. putida KT2440 did not lead to an increased glucose uptake rate, since it is likely equipped with mechanisms sensing and thereby preventing wastage of ATP. With the second approach we took advantage of P. putida KT2440 being equipped with an NAD+-dependent formate dehydrogenase converting formate to CO2 and NADH. Co-feed experiments of glucose and formate indicated that formate can be used as an electron source for NADH as an increased biomass yield on glucose was observed. Thus, a co-feed of formate constitutes a promising approach of increasing the NADH regeneration rate likely supporting redox biocatalysis with P. putida KT2440 under process relevant conditions. In addition, based on these results we developed an easy and fast whole cell assay for the estimation of NADH regeneration rates and the screening of redox enhancing substrates.All together this thesis contributes to the progress of implementing P. putida KT2440 as versatile and industrially relevant workhorse with the successful development of a reliable expression tool and the simple formate co-feeding strategy of increasing the regeneration rate of the main redox cofactor NADH.

OpenAccess:
PDF PDF (PDFA)
(additional files)