Untersuchungen zum Infektionsmechanismus des Asiatischen Sojabohnenrostpilzes Phakopsora pachyrhizi auf seiner Wirtpflanze Sojabohne

Löhrer, Marco; Panstruga, Ralph; Schaffrath, Ulrich

doi:urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-094662

Untersuchungen zum Infektionsmechanismus des Asiatischen Sojabohnenrostpilzes Phakopsora pachyrhizi auf seiner Wirtpflanze Sojabohne = Studies on the infection mechanism of the Asian soybean rust fungus Phakopsora pachyrhizi on its host plant soybean

Löhrer, Marco

2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Diplom-Biologe Marco Löhrer

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online-Ressource (168 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schaffrath, Ulrich (Thesis advisor)^RWTH* ; Panstruga, Ralph (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-11-04

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-094662
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/674473/files/674473.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/674473/files/674473.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
plant pathology (frei) ; crop plant (frei) ; genomics (frei) ; proteomics (frei) ; transcriptomics (frei) ; microscopy (frei) ; live cell imaging (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Phakopsora pachyrhizi SYD. & P. SYD, der Erreger des Asiatischen Sojabohnenrostes, gehört zu den wirtschaftlich bedeutendsten Schaderregern auf Sojabohne. Vollständig resistente Pflanzen sind derzeit nicht vorhanden und bei Fungizidanwendungen ist es oft nur eine Frage der Zeit, bis sich Fungizid-resistente Rassen gebildet haben. Ziel dieser Arbeit war es durch ein tiefergehendes Verständnis des Infektionsmechanismus Ansatzpunkte für neue innovative Bekämpfungsstrategien zu erlangen. Dabei wurden Methoden der Mikroskopie bzw. Histologie und der Molekularbiologie angewendet.Der erste kritische Schritt bei der Besiedelung von Wirtpflanzen durch P. pachyrhizi ist das Eindringen in das Blattgewebe. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die für Rostpilze untypische, direkte Penetration durch einen hohen Turgordruck in den nicht melanisierten, hyalinen Appressorien vermittelt wird. Hierzu wurde die sogenannte Mach-Zehnder Durchlicht-Interferometrie angewendet. Grundlage war die Bestimmung des gemittelten spezifischen Gangunterschieds, eine innerhalb dieser Studie erstmals verwendete Größe, welche die durch die gelösten Substanzen ausgelösten Phasenverschiebungen mit der Raumdimension der untersuchten Strukturen vereint. Anhand der Konzentration der Trockenmasse wurde das osmotische Potential der Zellinhalte unter Verwendung von substanzspezifischen Brechungsindexinkrementen (dn/dc) bestimmt. Hierzu wurden durch GC-TOF/MS Messungen die Inhaltsstoffe der Appressorien ermittelt. Es konnte schließlich ein osmotisches Potential von 3,9 MPa in den P. pachyrhizi Appressorien und 6,75 MPa in den zum Vergleich untersuchten M. oryzae Appressorien bestimmt und mittels der unabhängigen Methode der Grenzcytorrhyse bestätigt werden. Experimente mit Sojabohnenrost-Appressorien auf inerten PTFE-Membranen zeigten, dass dieser Druck alleine ausreichend ist um Membranen einer Dicke von 130 nm zu penetrieren, also im Bereich der Dicke der Sojabohne-Cuticula. Zur Beantwortung der Frage welche weiteren Faktoren das Eindringen in die Wirtpflanze und die Etablierung der biotrophen Interaktion beeinflussen können, sollten Untersuchungen des Genoms bzw. des Stadien-spezifischen Transkriptoms durchgeführt werden. Das Genom des Sojabohnenrostes war zu Beginn dieser Studie nicht sequenziert. Die Größenabschätzung des Genoms mittels teilweiser Sequenzierung und anschließender K-mer–Analyse ergab eine Genomgröße von ca. 1 Gb und deutete auf eine starke Heterozygosität der Genome der beiden Kerne hin. Basierend auf diesen Sequenzdaten war eine Assemblierung des Genoms nicht möglich. Deshalb wurde beschlossen, statt einer Genom-Sequenzierung die Sequenzen der proteincodierenden Gene durch eine Illumina mRNA Sequenzierung zu ermitteln. Hierzu wurde RNA von in vitro gekeimten Urediosporen mit aus Blattgewebe aufgereinigter Haustorien-RNA verglichen. Als Grundlage für die differentielle Transkriptabundanzbestimmung diente eine de novo Assemblierung der appressoriellen Sequenzfragmente, die 29.362 Sequenzen mit einem N50-Wert von 2868 bp lieferte. Diese Anzahl konnte über in silico Translation in putative Proteinsequenzen und Filtern der redundanten Sequenzen auf 20.612 Sequenzen reduziert werden. Die Analyse der in den Appressorien bzw. Haustorien hoch regulierten Transkripte zeigte Stadien-spezifische, distinkte Gruppen von Zellwand-abbauenden Enzymen (ZWAE) und kleinen, putativ sekretierten, die Interaktion beeinflussenden Proteinen (sogenannte Effektoren). Das de novo Transkriptom ermöglichte zudem die nano-LC-MS/MS basierte Identifikation von Proteinen, die von frühen Infektionsstadien in vitro sekretiert werden. Unter diesen Proteinen waren solche mit Signalpeptid signifikant angereichert. Auch hier konnten Zellwand-abbauende Enzyme und Effektoren gefunden werden.Eine stabile Deletion von zu charakterisierenden Genen oder eine gezielte Herunterregulation bestimmter Transkripte ist bei P. pachyrhizi bisher nicht möglich. Dies liegt vor allem an bisher nicht etablierten Transformations- und Selektionsmethoden von biotrophen Pilzen, zu denen auch P. pachyrhizi gehört. Um diese Limitation zu umgehen sollte die Möglichkeit der Herunterregulation von Genen durch exogen applizierte, kleine interferierende RNA (siRNA) sowie durch in der Pflanze gebildete siRNA getestet werden. Es gelang das Keimschlauchwachstum durch Herunterregulierung eines putativ an der Zellwandsynthese beteiligten beta-1,3-Glukansynthase-Gens zu reduzieren, wobei auch eine Verminderung der Transkriptabundanz gezeigt werden konnte. Mittels Agrobakterium-basierter transienter Expression von doppelsträngiger beta-1,3-Glukansynthase- und Sterol-14-alpha-Demethylase- RNA in Sojabohne konnte nach anschließender Inokulation mit Sojabohnenrost sogar eine Reduktion der Rostpusteln beobachtet werden. Durch die hier beschriebenen Arbeiten zum Infektionsmechanismus und dem im Rahmen dieser Arbeit de novo sequenzierten und assemblierten P. pachyrhizi Transkriptom, ist nun der Grundstein für weiterführende Studien, mit dem Ziel die Reduktion der Ernteerträge durch dieses Pathogen zu minimieren, gelegt.

Phakopsora pachyrhizi SYD. & P. SYD, the causal agent of Asian soybean rust is one of the economically most important pathogens on soybean. Plants resistant against all isolates of the fungus are not yet available and it is foreseeable that resistances against fungicides in use will occur. Therefore, this study aimed at gaining a deeper understanding of the infection mechanism with the goal of identifying novel and innovative strategies to combat the disease. Methods applied to reach that goal ranged from histology and microscopy to molecular biology.The first critical stage during the invasion of host plants by P. pachyrhizi is the penetration of the host tissue. In this study, it could be shown that the unusual direct penetration of P. pachyrhizi urediospores is mediated via a high turgor pressure in the hyaline, non-melanized appressoria. To achieve this, Mach-Zehnder transmission- light interferometry was applied. On basis of the “mean specific optical path difference” the concentration of substances in the cytosol of P. pachyrhizi and M. oryzae appressoria were compared. GC-TOF/MS measurements allowed the identification of appressorial cytosolic compounds, which were needed to determine the refractive index increments. Using this parameter, the osmotic potential of the cytosolic content of P. pachyrhizi and M. oryzae appressoria could be calculated to 3.9 MPa and 6.75 MPa, respectively. Incipient cytorrhysis was used as a method for independent verification of these results. Experiments on inert PTFE membranes showed that the pressure in the soybean rust appressoria alone is sufficient for penetration of membranes of thicknesses in the range of the soybean leaf cuticle (130 nm).Studies on the genome and transcriptome of P. pachyrhizi were conducted to answer the question which additional factors enable the penetration of the host plant and the establishment of the biotrophic interaction. Partial sequencing followed by K-mer analysis allowed the estimation of the size of the soybean rust genome to around 1 Gb and suggested a high degree of heterozygosity. Based on these results an Illumina-RNA-seq approach was followed. Early infection stages including appressoria and isolated fungal haustoria from late infection stages were sampled and RNA was extracted and sequenced. The de novo assembled transcriptome was comprised of 29.362 sequences with a N50-value of 2868 bp which could be narrowed down to 20.612 sequences via in silico translation and redundancy filtering. The differential expression analysis between appressorial- and haustorial stages revealed distinct groups of effectors and cell wall degrading enzymes. The de novo assembled transcriptome was further used for nano-LC-MS/MS based identification of proteins in the urediospore germination fluids. Among these proteins, those carrying a signal peptide were significantly enriched and cell wall degrading enzymes and effectors could be identified.Since stable deletion or silencing of genes is not yet possible in the obligate biotrophic fungus P. pachyrhizi, alternative methods for functional gene characterization were evaluated. Down-regulation of mRNA abundance via exogenous applied small interfering RNA (siRNA) or siRNA formed in planta were tested. Remarkably, it was possible to decrease germ tube length by transcriptional silencing of a cell wall biosynthesis associated beta-1,3-glucan-synthase gene Agrobacterium-mediated expression of a beta-1,3-glucan-synthase- and a sterol-14-alpha-demethylase-hairpin construct in planta led to decreased fungal growth after inoculation. The novel insights into the infection mechanism obtained in this study and the de novo sequenced and assembled transcriptome are a basis for further studies aiming at minimizing P. pachyrhizi’s detrimental impact on soybean production.