Bildung, Isolierung und Nachweis der mikrobiell gebildeten Speicherstoffe Polyphosphat und Polyhydroxybuttersäure bei ausgewählten Mikroorganismen

Schacht, Petra Yvonne; Dott, Wolfgang; Blank, Lars Mathias

doi:HT019140167

Bildung, Isolierung und Nachweis der mikrobiell gebildeten Speicherstoffe Polyphosphat und Polyhydroxybuttersäure bei ausgewählten Mikroorganismen = Formation, isolation and proof of the microbes produced storage substances polyphosphate and polyhydroxybutyric with selected microorganisms

Schacht, Petra Yvonne

2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Diplom Ingenieurin (Fachhochschule) Chemie Petra Yvonne Schacht

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online-Ressource (186 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Dott, Wolfgang (Thesis advisor) ; Blank, Lars Mathias (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-03-03

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-082998
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/672790/files/672790.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/672790/files/672790.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Polyphosphat (frei) ; Polyhydroxybuttersäure (frei) ; Phosphorrückgewinnung (frei) ; Bioplastik (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
In der vorliegenden Arbeit wird ermittelt, inwieweit die Bildung der mikrobiellen Speicher-stoffe Polyphosphat und Polyhydroxybuttersäure gefördert werden kann und diese isoliert werden können. Zudem wird ihre Einsatzmöglichkeit, über die biologische Funktion hinaus, im Bereich umweltschonender Produkte und Technologien angesprochen. Bedingt durch die umfassende Methodenentwicklung und die Untersuchung beider Speicher-stoffe setzt sich die vorliegende Arbeit aus den drei Bereichen Nachweismethoden für die polymeren Verbindungen Polyphosphat und Polyhydroxybuttersäure, die mikrobielle Bildung von Polyphosphaten sowie die mikrobielle Bildung von Polyhydroxybuttersäure zusammen. Es wurden Versuchsreihen im Labormaßstab durchgeführt, in denen unter selektiver Anreicherung von Mikroorganismen die Speicherstoffe Polyphosphat und Polyhydroxy-buttersäure gebildet werden. Die Verfahren für die Isolierung und den qualitativen und quantitativen Nachweis der Speicherstoffe wurden entwickelt beziehungsweise etabliert. Die gebildeten Polyphosphate konnten qualitativ und quantitativ mittels Mikroskopie, Fluoreszenzphotometrie und Gelelektrophorese nachgewiesen werden. Die Quantifizierung der Polyphosphate erfolgte nach Extraktion und durch Messung als Ortho-Phosphat. Allerdings bestehen bei den Nachweisverfahren methodische Schwierigkeiten hinsichtlich der Bestimmung der einzelnen Kettenlängen der Polyphosphate und deren Quantifizierung bedingt durch das Fehlen einheitlicher Standards. Die Ergebnisse sind deshalb kritisch zu betrachten und eine Optimierung der Nachweisverfahren ist anzustreben. Dennoch ist bei simultaner Betrachtung der Ergebnisse des Prozessablaufs aller angewendeten Nachweis-verfahren eine Übereinstimmung festzustellen, so dass die verschiedenen Methoden in der Kombination als zielführend angesehen werden können.Die gebildete Polyhydroxybuttersäure konnte aus der Zelle isoliert und qualitativ und quantitativ nachgewiesen werden. Der Nachweis erfolgte mikroskopisch, enzymatisch und mittels Gaschromatographie. Die Nachweisverfahren für Polyhydroxybuttersäure brachten zufriedenstellende Ergebnisse, da geeignete Standardsubstanzen vorlagen. Die Phosphataufnahme und Polyphosphatspeicherung wurde anhand der Mikroorganismen im Klärschlamm und unter besonderer Berücksichtigung des Pilzes Cunninghamella elegans untersucht. Es wurde festgestellt, dass Phosphat vorwiegend als Polyphosphat in der Zelle durch die Aktivität von Mikroorganismen gespeichert wird. Bei ungünstigen Kultivierungs-bedingungen, wie der Änderung des pH-Wertes, kam es zusätzlich zu direkt oder indirekt induzierten Fällungsreaktionen, wie der chemischen Ausfällung von Struvit (Magnesium-Ammonium-Phosphat). Zur Beurteilung der Untersuchungsergebnisse wurde die Kohlenstoff/ Stickstoff/Phosphor-Bilanz im Medium herangezogen. Im Vergleich zu den Mikroorganismen im Klärschlamm war der Pilz Cunninghamella elegans in der Lage ein Zehnfaches an Phosphat aus dem Medium zu eliminieren und intrazellulär als Polyphosphat zu speichern. Cunninghamella elegans konnte maximal 10 % Phosphat in der Biomasse festlegen, während die Klärschlammbiozönose höchstens 3 % Phosphat fixierte. Bei Cunninghamella elegans ergaben sich ein vielversprechender Ertrag an Biomasse und eine Polyphosphatspeicherung in kurzer Zeit. Allerdings scheitert die technische Nutzung der Polyphosphatproduktion an der Abtrennung der Polyphosphate von der Biomasse, die ohne Hydrolyse nicht möglich ist. Die mikrobielle Bildung und Speicherung von Polyhydroxybuttersäure wurde anhand der Bakterien Paracoccus denitrificans und Cupriavidus necator untersucht. Trotz unter-schiedlicher Kultivierungsbedingungen und eines sehr hohen Kohlenstoffverbrauchs, ist es nicht gelungen einen hohen Ertrag an Biomasse und Polyhydroxybuttersäure zu erreichen. Eine Optimierung der Verfahren ist deshalb notwendig. Die höchste Ausbeute an 3-Hydroxy-buttersäure betrug bei Paracoccus denitrificans und Cupriavidus necator maximal 50 % des Trockengewichts. Angesichts der im Labormaßstab erzielten Untersuchungsergebnisse sollte eine Über-tragung auf großtechnische Maßstäbe angedacht und untersucht werden. Um eine wirtschaftliche Einsatzmöglichkeit der Speicherstoffe zu erreichen, sind eine hohe Zelldichte an Mikroorganismen und damit eine hohe Ausbeute unumgänglich. Deshalb wurden für jeden Speicherstoff die untersuchten Mikroorganismen individuell ausgewählt. Zur Senkung der Produktionskosten bei der Polymerherstellung erscheint die Weiter-verarbeitung industrieller Abwässer ein Ansatzpunkt zu sein. Im Rahmen der Arbeit wurde anfallendes Prozesswasser aus der Industrie als Phosphatquelle den verwendeten Medien zugeführt und getestet. Die Isolierung und Quantifizierung der gebildeten Speicherstoffe aus Mikroorganismen ist, trotz Fortschritten in der Speicherstoffforschung, noch schwierig, da sich durch Hydrolyse Verluste ergeben können.Die Bildung und Gewinnung der mikrobiellen Speicherstoffe Polyphosphat und Poly-hydroxybuttersäure ist zurzeit noch nicht wirtschaftlich und nur bedingt technisch realisierbar.

The present paper is aimed at investigating to what extent the production of the microbial reserve substances polyphosphate and polyhydroxybutyrate can be enhanced and whether they can be isolated. In addition, the possibility of utilising these substances beyond their biological function in the field of environmentally friendly products and technologies is addressed. Owing to the comprehensive method development and the examination of both reserve substances, the present paper consists of three parts, namely methods of detecting the polymer compounds polyphosphate and polyhydroxybutyrate, the microbial production of polyphosphate and the microbial production of polyhydroxybutyrate. Laboratory-scale test series were performed to produce the reserve substances polyphosphate and polyhydroxybutyrate through selective enrichment of microorganisms. The methods for the isolation as well as the qualitative and quantitative detection of the reserve substances were developed and/or established. The produced polyphosphates were detected qualitatively and quantitatively by means of microscopy, fluorescence photometry and gel electrophoresis. The polyphosphates were quantified after extraction by measurement as orthophosphate. Due to a lack of uniform standards, however, the detection methods involve methodological difficulties regarding the determination of the individual chain lengths of the polyphosphates and their quantification, which is why the results should be seen with a critical eye and the detection methods require optimisation. Nevertheless, a simultaneous look at the process flow of all employed detection methods reveals consistent results, which is why the combination of the employed methods can be regarded as purposeful. The produced polyhydroxybutyrate was isolated from the cell and detected qualitatively and quantitatively. The employed detection methods included microscopy, enzyme-mediated assay and gas chromatography. The detection methods for polyhydroxybutyrate yielded satisfactory results, given the availability of suitable standard substances. The phosphate uptake and phosphate accumulation was examined on the basis of the microorganisms in sewage sludge, giving special regard to the fungus species Cunninghamella elegans. It was found that phosphate is accumulated in the cell predominantly as polyphosphate through the activity of microorganisms. At unfavourable culture conditions, such as a change in the pH value, directly or indirectly induced precipitation reactions, such as the chemical precipitation of struvite (magnesium ammonium phosphate) occurred additionally. The carbon/nitrogen/phosphorus ratio in the employed medium was taken as a basis for the assessment of the test results. Compared to the microorganisms in the sewage sludge, the fungus species Cunninghamella elegans was found to be capable of removing from the medium and accumulating in the cell as polyphosphate the tenfold amount of phosphate. Cunninghamella elegans was able to fix a maximum of 10% phosphate in the biomass, whereas the sewage sludge biocoenosis only fixed 3% of phosphate at maximum. Cunninghamella elegans produced a promising biomass yield and accumulated large amounts of phosphate within a short period of time. However, the technical utilisation of polyphosphate production is impracticable due to the necessity of separating the polyphosphates from the biomass, which is not possible without hydrolysis. The microbial production and accumulation of polyhydroxybutyrate was examined on the basis of the bacterial species Paracoccus denitrificans and Cupriavidus necator. Despite varying culture conditions and very high carbon consumption, it was not possible to achieve a high yield of biomass and polyhydroxybutyrate, which is why the method requires optimisation. The highest yield of 3-hydroxybutyrate with Paracoccus denitrificans and Cupriavidus necator amounted to 50% of the dry weight at maximum. In view of the test results achieved at laboratory scale, a transfer to industrial scale should be considered and investigated. The economical utilisation of the reserve substances requires a high cell density of microorganisms as well as a high yield. The tested microorganisms were therefore selected individually for each reserve substance. The further processing of industrial wastewater appears to be a starting point for reducing the production costs of polymers. As part of the tests, industrial process water was added to the employed media as a source of phosphate. Despite some progress in the research into reserve substances, the isolation of the produced reserve substances from microorganisms and their quantification is still difficult, since losses may occur in the course of hydrolysis.At present, the production and extraction of the microbial reserve substances polyphosphate and polyhydroxybutyrate is not yet economical and the method’s technical feasibility is limited.

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