Synthesis of protein/mineral composite materials

Richter, Marina Juliane; Böker, Alexander; Pich, Andrij

doi:urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-052967

Synthesis of protein/mineral composite materials = Synthese von Protein/Mineral-Kompositmaterialien

Richter, Marina Juliane

2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Marina Juliane Richter, M. Sc.

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online Ressource (V, 199 Seiten) : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Böker, Alexander (Thesis advisor) ; Pich, Andrij (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-07-08

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-052967
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/660303/files/660303.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/660303/files/660303.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
bio-inspired synthesis (frei) ; biomimetic synthesis (frei) ; template-directed synthesis (frei) ; biomineralisation (frei) ; hydrophobin (frei) ; lysozyme (frei) ; protein adsorption dynamics (frei) ; hydroxylapatit (frei) ; SiO2 (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
Die Arbeit umfasst die templatgesteuerte Synthese von Protein/Mineral-Kompositmaterialien in einem biomimetischen Ansatz. Es wurden zwei unterschiedliche Systeme entwickelt und eingehender untersucht: die Synthese von Protein/Hydroxylapatit-Kompositmaterialien und die Synthese von Lysozym/Siliziumdioxid-Kompositkapseln. Obwohl sich beide Systeme in der Art des Matrixproteins und der Mineralphase, als auch im Syntheseverfahren unterscheiden, basieren sie auf demselben Prinzip: proteinstabilisierte O/W-Emulsionen dienen grundlegend als Templat für Mineralhohlkapseln in der biomimetischen Synthese unter moderaten Synthesebedingungen. Die Synthese von Protein/Hydroxylapatit-Kapseln wurde aufbauend auf bereits vorhandenen Syntheseverfahren genauer untersucht und weiterentwickelt. Die Bildung der Protein/Hydroxylapatit-Kapseln erfolgte via proteinstabilisierter O/W-Emulsion. Proteinmoleküle assemblieren an O/W-Grenzflächen, wodurch eine Proteinmatrix um die Öltropfen gebildet wird. Die Proteinmatrix dient einerseits zur Stabilisierung der Öltropfen in wässrigem Medium und andererseits zur Induzierung von Kristallisation. Durch den Einsatz von Enzymen (Alkalische Phosphatasen) und unter der Verwendung eines Phosphatprecursors konnten die bisherigen langen Synthesezeiten, die eine ausreichende Mineralisierung sicherstellen, verkürzt werden. Mit Hilfe dieses Verfahrens konnte die Synthesezeit um den Faktor 6 verkürzt werden. Der zusätzliche Einsatz verschiedener Puffer bewirkt einen konstanten pH-Wert und somit optimale Enzymaktivität, wodurch eine Erhöhung der Kapselausbeute erzielt werden konnte. Die Verwendbarkeit sowohl weicher als auch harter Template innerhalb der biomimetischen Mineralisierung wurde des Weiteren untersucht. Vier organische Flüssigkeiten (Perfluoroctan, Silikonöl, Hexan und Styrol) konnten als geeignete apolare Phasen (weicher Template, engl. soft templates) innerhalb der templatgesteuerten Synthese von Mineralhohlkapseln identifiziert werden. Die Art der verwendeten apolaren Phase in Verbindung mit entsprechender Proteinfaltung beeinflusst die Kristallisation, was zu unterschiedlichen Kapselstrukturen führt. Die erfolgreiche Mineralisierung unter der Verwendung harter Template (engl. hard templates; PTFE Substrate, mikrostrukturierte superhydrophile-superhydrophobe Substrate und PFDTS-beschichtete Siliziumwafer) konnte darüber hinaus zusätzlich realisiert werden.Fünf verschiedene Hydrophobine der Klasse I und II (H*Protein A, H*Protein B, TT1, HFBI und HFBII), als auch weitere Proteine (κ-Casein und Fetuin-A) wurden als Matrixprotein im Rahmen verschiedener Synthesen eingesetzt. Die Ergebnisse zeigen gut mineralisierte Kapseln, die jedoch deutliche Unterschiede bei der Kapselausbeute, Bulkmineralanteil, als auch der Kapselstruktur in Abhängigkeit zum eingesetzten Protein zeigen. Diese Versuche verdeutlichen, dass die templatgesteuerte biomimetische Synthese nicht auf die Anwendbarkeit eines einzigen Proteins beschränkt ist. Im Weitern konnte somit gezeigt werden, dass mit Hilfe des jeweilig eingesetzten Proteins die Kapselstruktur gezielt modifiziert werden kann.Calciumphosphat in Form von Hydroxylapatit bildet die Mineralphase der Komposithohlkapseln. In Mineralisationsversuchen konnte gezeigt werden, dass die Mineralphase durch niedermolekulare Verbindungen (Citrat, EDTA, EGTA und HEDTA) verändert werden kann. Die Einlagerung von Ag-, Au-, SiO2-, TiO2- und ZnO2-Partikeln (in nm- oder µm-Maßstab) in die Mineralphase via Pickering-Effekt ermöglicht eine gezielte Funktionalisierung der Kapseln, z.B. als Katalysator oder Mikroreaktor. Ergänzende Messungen der Grenzflächenspannung verschiedener Systeme führten zu einem besseren Verständnis der zugrundeliegenden Vorgänge der Proteinadsorption an Grenzflächen.Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein weiteres Syntheseverfahren untersucht und entwickelt. Die Synthese von Lysozym/Siliziumdioxid-Kompositkapseln erfolgte via enzymstabilisierten O/W-Emulsionen. Das verwendete Enzyme Lysozym assembliert an der O/W-Grenzfläche und katalysiert die Umsetzung des Siliziumdioxid-Precursor (apolare Phase) zu Siliziumdioxid. Im Allgemeinen, erzielt die Synthese gut mineralisierte Kapseln mit hohen Ausbeuten innerhalb 1-2 Tagen. Die Kapseln zeigen gute Stabilität über mindestens 30 Tage. TEOS und PEOS konnten als geeignete Precursor identifiziert werden, wobei der verwendete Precursor die Kapselstruktur beeinflusst.Des Weiteren wurde der Einfluss von ionischen Additiven (CTAB, SDS und THpmp) als Co-Stabilisatoren auf die Tropfenstabilität und Kristallisation von Siliziumdioxid untersucht. Kapselwachstum konnte dabei unter der Verwendung von CTAB und SDS, jedoch nicht unter der Verwendung von THpmp, erzielt werden. Zur Vermeidung der Proteindenaturierung durch SDS, wurde Hexylenglykol (MPD) bei der Synthese verwendet. MPD reduziert die Bindungsaffinität zwischen Protein und SDS. Analog zu den Protein/Hydroxylapatit-Kapseln, konnte die erfolgreiche Einlagerung verschiedene Nanopartikel (Au, CaO2, Fe3O4, TiO2 und ZnO2) in die Mineralphase der Siliziumdioxidkapseln erzielt werden.

This thesis deals with the template-directed synthesis of protein/mineral composite materials via a biomimetic approach. Two different systems were developed and further investigated: synthesis of protein/hydroxyapatite composite materials and synthesis of lysozyme/silica composite capsules. Both systems differ in the type of matrix protein and mineral phase, as well as in the synthesis procedure but follow the same underlying principle: protein-stabilised o/w emulsions are generally used as templates for hollow mineral capsules in biomimetic synthesis routes under mild conditions. On the basis of an existing synthesis procedure, synthesis of protein/hydroxyapatite composite capsules was refined and further investigated. The formation of protein/hydroxyapatite capsules was performed via a protein-stabilised o/w emulsion. Protein molecules self-assemble at o/w interfaces forming a protein matrix covering the oil droplets. This protein matrix stabilises the oil droplets in aqueous media on the one hand and induces interfacial crystallisation on the other hand. Long synthesis times ensuring sufficient mineralisation were shortened by the use of enzymes (alkaline phosphatases) in combination with a phosphate precursor phase. This procedure enables mineralisation within one week reducing the mineralisation time by the factor six. Changing the synthesis media by buffer addition causes constant pH and therefore optimal enzyme activity increasing capsule yield. Temperature increase up to 37°C further improves enzyme activity and thus capsule yield.Both soft and hard templates were tested to verify their usability in biomimetic mineralisation. Four organic liquids (perfluorooctane, silicone oil, hexane and styrene) were used as apolar phase and turned out to be applicable as soft templates in the synthesis of hollow mineral capsules. The type of organic liquid in combination with protein folding has an impact on mineralisation causing different capsule surface morphologies. Furthermore, successful mineralisation was performed using hard templates (PTFE substrates, micropatterned superhydrophilic-superhydrophobic substrates and PFDTS-coated silicon wafers) as well.Well-mineralised capsules were synthesised using five different hydrophobins of class I and II (H*Protein A, H*Protein B, TT1, HFBI and HFBII), κ-casein and fetuin-A as matrix protein. Obtained capsules differ in capsule yield, bulk mineral amount and capsule surface structure. These results demonstrate that this synthesis procedure is not limited to one protein type; moreover, it was shown that capsule morphology can be tuned by the choice of protein type.The mineral phase of the composite hollow capsules consists of calcium phosphate in form of hydroxyapatite. Mineralisation experiments showed that the mineral phase can be altered by low molecular agents (citrate, EDTA, EGTA and HEDTA). Going a step further, successful incorporation of Ag, Au, SiO2, TiO2 and ZnO2 particles (in nm or µm scale) into the mineral phase via Pickering-effect was performed to enable functionality, for instance as catalysts or micro-reactor.Additional interfacial tension measurements were performed in order to gain a deeper understanding of underlying principles of protein self-assembly at interfaces. A second synthesis procedure has been investigated and further developed within this thesis as well. The formation of lysozyme/silica composite capsules was performed via an o/w emulsion stabilised by the enzyme lysozyme. Lysozyme assembles at the o/w interface where it converts the silica precursor phase (apolar phase) to silica. In general, well-mineralised capsules were synthesised with high capsule yields within 1-2 days and are stable over at least 30 days. TEOS and PEOS were identified as suitable precursor phases. The type of silica precursor phase alters the capsule surface morphology.The influence of ionic additives (CTAB, SDS and THpmp) as co-stabiliser on droplet stability and silica crystallisation were further investigated. While capsule growth could be obtained in the presence of CTAB and SDS, no capsule formation could be achieved in the presence of THpmp. Since SDS causes protein denaturation, hexylene glycol (MPD) has to be added to synthesis reducing protein-binding affinity of SDS in order to prevent protein denaturation. In accordance to protein/hydroxyapatite composite capsules, several nanoparticles (Au, CaO2, Fe3O4, TiO2 and ZnO2) were successfully incorporated into the silica capsule shell as well.

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