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Monitoring, characterizing, and influencing the poly(γ-glutamic acid) production by Bacillus licheniformis = Monitoring, Charakterisierung und Beeinflussung der γ-Polyglutaminsäureproduktion von Bacillus licheniformis



Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Lena Elisabeth Meißner

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online Ressource (XVIII, 118 Seiten) : Illustrationen


Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University


Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
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Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-06-10

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-052661
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/660263/files/660263.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/660263/files/660263.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

  1. Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik (416510)

Projekte

  1. 0313917D - Industrieinitiative GenoMik Design - Effizienzsteigerung biotechnologischer Produktionsverfahren - Genomic Design eines Bacillus-Produktionssystems zur Produktion technischer Enzyme, Proteine und Peptide auf Basis von Bacillus licheniformis (BMBF-0313917D)
  2. GRK 1628 - GRK 1628: Selektivität in der Chemo- und Biokatalyse (135945478) (135945478)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Bacillus licheniformis (frei) ; protease (frei) ; poly(γ-glutamic acid) (frei) ; viscosity (frei) ; power input (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Bei der Produktion industrieller Enzyme werden sehr häufig Arten der Gattung Bacillus eingesetzt. Diese Bacillus-Arten sind allerdings auch dafür bekannt, das Biopolymer γ-Polyglutaminsäure (γ-PGA) herstellen zu können. Die Bildung von Biopolymeren erhöht die Viskosität des Fermentationsmediums und beeinflusst die Durchmischung, den Wärmeaustausch und den Massentransfer zwischen Gas- und Flüssigphase im Bioreaktor. Eine unerwünschte Biopolymerbildung hat sowohl großen Einfluss auf die Fermentation als auch auf die anschließende Produktaufarbeitung. In dieser Arbeit wird gezeigt, wie die unerwünschte γ-PGA-Bildung eines industriellen Bacillus licheniformis Proteaseproduktionsstamms (A1) unterdrückt werden kann, indem als Stickstoffquelle Nitrat anstelle von Ammonium eingesetzt wird. Dadurch konnte die Viskosität des Mediums um über 90 % gesenkt werden, während sich die Proteaseaktivität durch den Austausch der Stickstoffquelle nicht veränderte. Es wurden Proteaseaktivitäten von 38 und 46 U mL-1 für Ammonium und Nitrat erreicht. Es wurde die Anwendbarkeit für Kultivierungen im Schüttelkolben und im 3 L Rührkessel gezeigt. Die erzielten Erkenntnisse ermöglichen es, in Zukunft industrielle Produktionsprozesse zur Proteaseherstellung mit Bacillus-Stämmen durchzuführen, ohne das Schüttelkolben- und Rührkesselfermentation durch unerwünschte γ-PGA-Bildung gestört werden. Bacillus-Arten werden aber nicht nur zur Enzymproduktion, sondern auch zur industriellen Produktion des Biopolymers γ-PGA eingesetzt. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich daher mit der Charakterisierung eines typischen γ-PGA-produzierenden Bacillus licheniformis Stammes (ATCC 9945), der in Schüttelkolbenexperimenten unter sogenannten Standardbedingungen kultiviert wurde, die aus der entsprechenden Literatur übernommen wurden. Es zeigte sich, dass unter diesen Bedingungen eine starke Sauerstofflimitierung vorlag, und dass nach einer gewissen Kultivierungszeit die Sauerstofftransferraten (OTR) der bis dahin sehr ähnlich gelaufenen Kulturen unterschiedlich verliefen. Einige der Kulturen stellten ihre Atmungsaktivität vergleichsweise früh ein, während andere Kulturen noch mehrere Tage Atmungsaktivität zeigten. Ein frühes Einbrechen der OTR konnte dabei immer mit einem sehr niedrigen pH-Wert assoziiert werden. Die offline gemessene, effektive Viskosität diente als Maß für die γ-PGA-Bildung. Die maximale effektive Viskosität wurde nach 24 bis 48 h gemessen. Das Aufspalten der OTR-Kurven der bis dahin gleich gewachsenen Kulturen trat erst anschließend auf. Das nicht reproduzierbare Verhalten der Kulturen hatte somit keinen Einfluss auf die Produktbildung. Nach Erreichen der maximalen effektiven Viskosität war immer ein deutlicher Abfall der Viskosität zu beobachten, der auf den Beginn des enzymatischen γ-PGA-Abbaus hinwies. Der Zeitpunkt der maximalen effektiven Viskosität korrelierte mit einem vollständigen Verbrauch von Zitronensäure und Phosphat. Verschiedene Medienzusammensetzungen und Füllvolumina wurden im Hinblick auf ihren Einfluss auf die γ-PGA-Bildung untersucht. Eine höhere Zitronensäurekonzentration im Medium führte zu einer deutlichen Erhöhung der maximalen Viskosität, während eine höhere Phosphatkonzentration unter Standardbedingungen keinen Einfluss zeigte. Eine Kombination aus erhöhter Zitronensäure- und Phosphatkonzentration hatte hingegen einen zusätzlichen positiven Effekt. Die Kombination aus erhöhter Zitronensäure- und Ammoniumkonzentration führte jedoch zu niedrigen pH-Werten und daraus resultierend zu einem frühen Einbruch der OTR. Durch verschiedene Füllvolumina konnten unterschiedliche Niveaus einer Sauerstofflimitierung bzw. nicht sauerstofflimitierte Bedingungen eingestellt werden. Die verschiedenen Bedingungen hatten einen starken Einfluss auf Wachstum und γ-PGA-Bildung, wobei ein gewisses Maß an Sauerstofflimitierung von Vorteil für die γ-PGA-Bildung war. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde ein Orbitalschüttler mit einem Drehmomentsensor zur Leistungseintragsmessung eingesetzt, um die γ-PGA-Bildung und den Abbau online zu verfolgen. Der online gemessene, volumetrische Leistungseintrag korrelierte hier sehr gut mit der offline bestimmten, effektiven Viskosität. Messungen des Molekulargewichts und der γ-PGA-Konzentration zeigten dabei, dass Viskosität und Leistungseintrag stärker von Änderungen des Molekulargewichts als von Konzentrationsänderungen beeinflusst wurden. Eine höhere Viskosität aufgrund einer höheren Zitronensäurekonzentration oder der Zugabe von Spurenelementen ließ sich mit Hilfe des Leistungseintragssignals nachweisen. Darüber hinaus zeigte der Vergleich der Stämme ATCC 9945 und A1, dass verschiedene Stämme unterschiedliche γ-PGA-Bildungskinetiken aufweisen können, die durch die Leistungseintragsmessung sehr gut erfasst wurden. Abschließend konnte eine Korrelationsgleichung aus den Daten der offline bestimmten Viskosität und des online gemessenen Leistungseintrags aufgestellt werden, die die Berechnung eines kontinuierlichen Viskositätsverlaufs aus den Leistungseintragsdaten ermöglicht.

Bacillus spp. are used for the production of industrial enzymes, such as proteases for the detergent industry, but are also known to be capable of producing biopolymers such as poly(γ-glutamic acid) (γ-PGA). Biopolymers increase the viscosity of the fermentation broth, thereby impairing mixing, gas/liquid mass transfer, and heat transfer in any bioreactor system. Undesired biopolymer formation has a significant impact on fermentation and downstream processing performance, respectively. The first part of this thesis shows how undesirable γ-PGA formation of an industrial protease producing Bacillus licheniformis strain (A1) was prevented by switching the nitrogen source from ammonium to nitrate. The maximum viscosity at a shear rate of 300 s-1 was reduced by over 90 %, while enzyme production was not affected. Protease activities of 38 and 46 U mL-1 were obtained for ammonium and nitrate, respectively. The applicability was shown for shake flask and lab scale stirred tank bioreactor cultivations. With the presented results, protease production with industrial Bacillus strains is now possible without undesired γ-PGA formation and its negative impact on shake flask and stirred tank bioreactor fermentations.On the other hand, Bacillus species are also used for the commercial production of the biopolymer γ-PGA. The second part of the thesis presents the characterization of the typical γ-PGA producing Bacillus licheniformis strain ATCC 9945 in shake flask cultivations under standard cultivation conditions from the literature. The cultivations were strongly oxygen limited, and after a certain time, the oxygen transfer rates of the parallel running cultures diverged. The respiration activity of some cultures ceased while others continued for several days. An early termination of respiration activity could always be attributed to a low pH value. Sample viscosity, which is an indirect measure of γ-PGA formation, was maximal after 24 to 48 h, thus preceding the parallel cultures’ diverging. The observed non-reproducible growth, therefore, did not interfere with γ-PGA production. After its maximum was reached, the effective viscosity decreased severely, indicating the start of the enzymatic degradation of γ-PGA. The maximum of effective viscosity coincided with a depletion of citric acid and phosphate. Different medium compositions and filling volumes were investigated for their influence on γ-PGA production. A higher initial citric acid concentration increased the maximum effective viscosity significantly while a higher initial phosphate concentration had no impact under standard conditions. More citric acid in combination with more phosphate was beneficial for the γ-PGA production. However, the increase of citric acid and ammonium concentrations at the same time led to low pH values and early termination of the respiration activity. By using different filling volumes, different levels of oxygen transfer capacities were induced, resulting in oxygen unlimited or limited conditions. The different oxygen transfer capacities were shown to exhibit a strong influence on growth and γ-PGA formation. It could be demonstrated that a certain level of oxygen limitation is useful for the γ-PGA production process. In the third part of this thesis, online measurement of the volumetric power input is applied to follow γ-PGA formation and degradation continuously during a running cultivation. The online measured power input corresponded well to the offline measured effective viscosity. The determination of molecular weight and concentration of γ-PGA showed that viscosity and power input depended more strongly on changes of the molecular weight than of the concentration. The increase in viscosity due to a higher citric acid concentration or the supplementation of trace elements was also detectable with the online measured power input signal. Moreover, the power input measurement was useful to reveal different production patterns of γ-PGA producing strains, as was demonstrated by a comparison of the strains ATCC 9945 and A1. Finally, a correlation between offline determined viscosity and online measured power input was established which enabled the calculation of a continuous viscosity signal from the online measured power input.

OpenAccess:
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Dokumenttyp
Dissertation / PhD Thesis

Format
online

Sprache
English

Externe Identnummern
HBZ: HT019031295

Interne Identnummern
RWTH-2016-05266
Datensatz-ID: 660263

Beteiligte Länder
Germany

 GO


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Document types > Theses > Ph.D. Theses
Faculty of Mechanical Engineering (Fac.4)
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Publications database
416510

 Record created 2016-07-11, last modified 2023-04-08