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Mikrofluidische Sensoren in der Durchflusszytometrie zur kombinierten optisch-elektrischen Analyse an Blutzellen = Microfluidic sensors in flow cytometry for combined optical-electrical analysis of blood cells



Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Diplom-Physiker Peter Simon

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online-Ressource (132 Seiten) : Illustrationen, Diagramme


Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University


Genehmigende Fakultät
Fak06

Hauptberichter/Gutachter
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Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-01-25

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-047163
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/659416/files/659416.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/659416/files/659416.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

  1. Lehrstuhl für Werkstoffe der Elektrotechnik I und Institut für Werkstoffe der Elektrotechnik (611510)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
markierungsfreie durchflusszytometrische Zelldifferenzierung (frei) ; mikrostrukturierte Durchflusszytometer (frei) ; Vollblutanalyse (frei) ; Einzelzellanalyse (frei) ; Blutbild (frei) ; Mikropartikel (frei) ; Immunfluoreszenz (frei) ; DNA-Färbung (frei) ; Impedanz Durchflusszytometrie (frei) ; Impedanzspektroskopie (frei) ; Malaria (frei) ; intraerythrozytäre Parasiten (frei) ; label-free cell differentiation (frei) ; whole blood analysis (frei) ; micro fabricated flow cytometer (frei) ; single cell analysis (frei) ; complete blood count (frei) ; immunofluorescence (frei) ; impedance flow cytometry (frei) ; impedance spectroscopy (frei) ; DNA staining (frei) ; infected red blood cells (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 621.3

Kurzfassung
Die Analyse des menschlichen Blutes dient in der humanmedizinischen Diagnostik der Benennung und Klassifizierung von Krankheitsbildern. Die Konzentrationsbestimmung der zellulären Bestandteile einer Blutprobe ist Schwerpunkt der Durchflusszytometrie. Dabei werden je nach Messprinzip optische und elektrische Durchflusszytometer unterschieden.Im Rahmen dieser Arbeit wurden sowohl neuartige mikrostrukturierte durchflusszytometrische Sensoren für kombinierte optische und elektrische Untersuchungen an Blutzellen entwickelt als auch potenzielle Anwendungsgebiete in der klinischen Diagnostik aufgezeigt, die mit konventionellen Methoden bisher nicht durchführbar sind. Die Mikrosystemtechnik begünstigt die Entwicklung von komplexen Elektrodenarrays für elektrische Analysen in transparenten mikrometergroßen Durchflusskanälen, deren hohe Oberflächenqualität die Untersuchung von laserinduzierten Messgrößen erlaubt. Bei der Herstellung der mikrostrukturierten Sensoren wurden sowohl lithografische Verfahren und nasschemische Ätzprozesse zur Formung der Durchflusskanäle als auch Galvanotechniken und Kathodenzerstäubung zur Strukturierung der Elektroden angewandt. Dies ermöglichte die Herstellung eines aus Glas, SU-8 und PDMS bestehenden Sensors sowie drei weiterer, nahezu vollständig auf Glas basierender Sensoren mit hervorragenden optischen Eigenschaften.Die Leistungsfähigkeit der mikrostrukturierten durchflusszytometrischen Sensoren wurde mit fluoreszierenden, monodispersen Mikropartikeln validiert und mit marktüblichen Durchflusszytometern verglichen. Im Ergebnis waren die Empfindlichkeit und die Messstabilität bei den Mikrostrukturen besser oder vergleichbar mit kommerziellen Durchflusszytometern. Zudem wurde eine Charakterisierung der Impedanzeigenschaften von Blutzellen über einem weiten Frequenzbereich bis zu 100 MHz durchgeführt. Damit wurden optimale Frequenzen identifiziert, die mit dem Zellvolumen, der Membrankapazität oder der Leitfähigkeit des Zytoplasmas korrelieren und eine markierungsfreie Differenzierung der Blutzellen ermöglichen. Zur Verifizierung der markierungsfreien Messgrößen diente eine simultane Analyse der Immunfluoreszenz als Referenzmethode. In hämolysiertem Blut konnte durch die kombinierte Messung der Impedanz und der seitlichen Lichtstreuung eine markierungsfreie Differenzierung von Leukozyten-Subpopulationen für das Differentialblutbild erzielt werden. Desweiteren wurde erstmalig eine Differenzierung von Thrombozyten, Erythrozyten, Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten in nicht-hämolysierten Vollblutproben durch die Impedanzmessung erfolgreich durchgeführt. Diese neuartige Methode zur Bestimmung des kleinen Blutbildes und des Differentialblutbildes kommt somit ohne Laser und zugehöriger Optik aus. Bis auf die Verdünnung der Probe entfallen alle weiteren Präparationsschritte. Neben Vollblut von gesunden Probanden wurden im Rahmen dieser Arbeit auch pathologische Proben untersucht, die mit Malaria-Erregern infiziert waren. Ziel war die elektrische Differenzierung von gesunden und infizierten Erythrozyten anhand der pathologischen Änderung des Zell-Innenwiderstandes, die durch den Einfluss des Erregers hervorgerufen wird. Hierzu wurden Plasmodium falciparum Parasiten am Max-Planck-Institut für Infektions-biologie kultiviert und mit klinischen Malaria-Proben von der Charité-Infektionsepidemiologie verglichen. Es zeigte sich, dass befallene Erythrozyten im Trophozoit- oder im Schizont-Stadium durch die Messung der Impedanz markierungsfrei differenzierbar sind. Die Analyse von intraerythrozytären Ring-Stadien, die in klinischen Proben überwiegen, ist dagegen herausfordernd. Impedanzspektroskopische Untersuchungen ergaben, dass sich die Differenzierung der Ring-Stadien mit steigender Frequenz jedoch verbessert und einen schnellen und kostengünstigen Malaria-Befund unterstützt. Eine vollständige Differenzierung aller parasitären Stadien konnte in den Mikrostrukturen mittels Fluoreszenzmessung nach Einfärbung der Erreger-DNA erzielt werden. Nach einem positiven markierungsfreien Befund ist somit eine präzise optische Bestimmung der Parasitenkonzentration zur Überwachung des Krankheitsverlaufs durch die Fluoreszenzmessung am selben Gerät möglich.

I developed microfluidic sensors for label-free flow cytometric cell differentiation by combined multiple AC electrical impedance and light scattering analysis. The measured signals are correlated to cell volume,membrane capacity and optical properties of single cells. For an improved signal to noise ratio, the microfluidicsensor incorporates two electrode pairs for differential impedance detection. One-dimensional sheath flow focusing was implemented, which allows single particle analysis at kHz count rates. Various monodisperse particles and differentiation of leukocytes in haemolysed samples served to benchmark themicrodevice applying combined AC impedance and side scatter analyses. In what follows, we demonstratet hat AC impedance measurements at selected frequencies allow label-free discrimination of platelets,erythrocytes, monocytes, granulocytes and lymphocytes in whole blood samples involving dilution only. Immunofluorescence staining was applied to validate the results of the label-free cell analysis. Reliable differentiation and enumeration of cells in whole blood by AC impedance detection have the potential to support medical diagnosis for patients with haemolysis resistant erythrocytes or abnormally sensitive leucocytes, i.e. for patients suffering from anaemia or leukaemia. Further, analysis of malaria-infected blood was accomplished. Differentiation and enumeration of infected red blood cells were achieved through various techniques. Label-free measurements, including AC electrical impedance and light scattering facilitate the possibility for true-false diagnosis. In addition, measurements including DNA staining enable a precise count of infected red blood cells allowing for monitoring of disease states.

OpenAccess:
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Dokumenttyp
Dissertation / PhD Thesis

Format
online

Sprache
German

Externe Identnummern
HBZ: HT019015794

Interne Identnummern
RWTH-2016-04716
Datensatz-ID: 659416

Beteiligte Länder
Germany

 GO


OpenAccess

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The record appears in these collections:
Document types > Theses > Ph.D. Theses
Faculty of Electrical Engineering and Information Technology (Fac.6)
Publication server / Open Access
Public records
Publications database
611510

 Record created 2016-06-22, last modified 2023-04-08