Akkumulation von L-Malat und D-Lactat in Arabidopsis thaliana und Laccase/HBT-vermittelte Delignifizierung von Spartina alterniflora und Phragmites australis

Heil, Alexander; Conrath, Uwe; Kreuzaler, Fritz

doi:urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-046351

Akkumulation von L-Malat und D-Lactat in Arabidopsis thaliana und Laccase/HBT-vermittelte Delignifizierung von Spartina alterniflora und Phragmites australis = Accumulation of L-malate and D-lactate in Arabidopsis thaliana and laccase/HBT mediated delignification of Spartina alterniflora and Phragmites australis

Heil, Alexander

2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Diplom-Biologen Alexander Heil

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online-Ressource (viii, 175 Seiten) : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Kreuzaler, Fritz (Thesis advisor) ; Conrath, Uwe (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-05-10

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-046351
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/659315/files/659315.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/659315/files/659315.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Laccase (frei) ; Lactat (frei) ; Malat (frei) ; MDH (frei) ; PEPC (frei) ; TDT (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die vorliegende Arbeit besteht aus den Teilprojekten „Akkumulation von L-Malat und D-Lactat in Arabidopsis thaliana“ (A) und „Laccase/HBT-vermittelte Delignifizierung von Spartina alterniflora und Phragmites australis“ (B). Im Rahmen des Teilprojekts A sollte L-Malat bzw. D-Lactat in A. thaliana-Pflanzen hyperakkumuliert werden. Die Anreicherung von L-Malat erfolgte durch Modifizierung des pflanzlichen Stoffwechsels mit den Enzymen PEPC, MDH und dem Tonoplast-Dicarboxylat-Transporter (TDT). Dazu wurden die Gene PEPCi2 (Hydrilla verticillata), MDH5 (Zea mays) und TDT (Arabidopsis thaliana) im Pflanzen-Expressionsvektor pTRA-K-PEPCi2-TDT-$\lambda$F-MDH5 vereint und A. thaliana-Pflanzen stabil transformiert. Die Enzyme PEPC und MDH vermitteln die Carboxylierung des PEP zum Oxalacetat, mit anschließender Reduktion des Oxalacetats zum L-Malat. Der TDT transportiert L-Malat aus dem Zytosol in Vakuole, das dort verstärkt angereichert wird. Zur Anreicherung von D-Lactat wurden A. thaliana-Pflanzen mit dem Vektor pTRA-K-RbcS-1A-D-LDHA-pA3’g7 stabil transformiert. Der Vektor enthielt das zuvor isolierte D-LDHA-Gen aus E. coli, codierend für eine Pyruvat reduzierende D-LDH mit weitgehend unidirektionaler Reaktionsrichtung. Die Expression der Transgene PEPCi2, MDH5, TDT und D-LDHA, sowie die erhöhte Aktivität der Enzyme MDH und PEPC konnte mithilfe der qRT-PCR bzw. der Enzymaktivitäts-Messungen bei A. thaliana-Pflanzen der T1-Generation nachgewiesen werden. Mithilfe des enzymatischen Malat-Tests wurde ein erhöhter L-Malat-Gehalt des Blatt-Zellysats der pTRA-K-PEPCi2-TDT-$\lambda$F-MDH5-Transformanten der T1-Generation nachgewiesen. Der Nachweis der D-LDH-Aktivität im Zelllysat der Transformanten gelang nicht. Auch D-Lactat war enzymatisch nicht nachweisbar. Im weiteren Verlauf wurde die nachfolgende Generation (T2) beider Transformanten-Typen der GC/MS-Analyse unterzogen. Transformanten zur D-Lactat-Anreicherung enthielten durchschnittlich 2,32-mal mehr Lactat, als Transformanten zur L-Malat-Anreicherung. Umgekehrt, enthielten Transformanten zur L-Malat-Anreicherung durchschnittlich 2,08-mal mehr Malat. Mithilfe statistischer Analysen konnte ein signifikanter Unterschied der Lactat- und Malat-Konzentration zwischen den beiden Transformanten-Typen nachgewiesen werden. Im Teilprojekt „Laccase/HBT-vermittelte Delignifizierung von Spartina alterniflora und Phragmites australis“ (B), wurde die Vorarbeit für eine chemisch-enzymatische Methode zu Delignifizierung von Nicht-Holz-Pflanzen geleistet. Das Ziel ist ein nachhaltiger und umweltschonender Ligninabbau. Die enzymatische Komponente bildete das Laccase/Mediator-System und die chemische das H2O2 und das NaOH. Als Modelpflanzen dienten die Nicht-Holz-Pflanzen Spartina alterniflora (Glattes Schlickgras) und Phragmites australis (Schilfrohr). Insgesamt wurden drei Enzyme ausgewählt: die Mangan-Peroxidase (MnP), die Lignin-Peroxidase (LiP) und die Laccase (Lacc). Jedes der drei Gene konnte kloniert und mithilfe des Hefe-Expressionsvektors pPIC9K in P. pastoris exprimiert werden. Es gelang aber nur, die von P. pastoris synthetisierte Laccase, in ausreichenden Mengen aufzukonzentrieren und in Kombination mit dem Mediator HBT und H2O2 zur Delignifizierung oben genannter Pflanzen einzusetzen. Durch photometrische Messung der Extinktionsänderung und Bestimmung der Integralwerte der Spektralbereiche, konnte beim gemeinsamen Einsatz von Laccase, HBT und H2O2, eine Verringerung des Ligningehalts im Pflanzenmaterial von ca. 25 % erreicht werden.

The current work contains two projects "Accumulation of L-malate and D-lactate in Arabidopsis thaliana" (A) "Laccase/HBT mediated delignification of Spartina alterniflora and Phragmites australis" (B). In project A, L-malate and D-lactate accumulated in A. thaliana plants. The accumulation of L-malate is carried out by modification of the plant metabolism with the enzymes PEPC, MDH and the tonoplast dicarboxylate transporter (TDT). Gene pepci2 (Hydrilla verticillata), mdh5 (Zea mays) and tdt (Arabidopsis thaliana) were cloned in a plant expression vector pTRA-K-PEPCi2-TDT-$\lambda$F-MDH5. These genes were combined and stable transformed into A. thaliana plants. The Enzyme PEPC catalyzes the addition of bicarbonate to phosphoenolpyruvate (PEP) to form the oxaloacetate and inorganic phosphate. Further the oxaloacetate is visibly reduced to the L-malate by the MDH. L-malate was transported by TDT from the cytosol in to the vacuole, and accumulated there. For the accumulation of D-lactate in A. thaliana plants was used the vector pTRA-K-RbcS-1A-D-LDHA-pA3'g7 and stable transformed in to A. thaliana plants. The vector contained the previously isolated D-ldhA gene from E. coli, coding for a largely one-way direction working, pyruvate-reducing D-LDH. The expression of the transgenes pepci2, mdh5, tdt and ldhA the increased activity of enzymes MDH and PEPC was shown using qRT-PCR and the enzyme activity also measured in A. thaliana plants in the T1 generation. An increased L-malate content of the leaf lysate of transformants of T1 generation has been demonstrated using the enzymatic test of L-malate. The detection of D-LDH activity in the cell lysate of transformants failed. Also D-lactate was enzymatically undetectable. The next generation (T2) of both types of transformants was further analyzed by GC/MS. “D-lactate transformants” contains the average of 2.32 times more D/L-lactate than of “L-malate transformants”. Vice versa, L-malate transformants contained average 2.08 times more L-malate. Using statistical analysis, a significant difference between two types of transformants of lactate and malate concentrations could be detected. In project B, "Laccase/HBT mediated delignification of Spartina alterniflora and Phragmites australis" (B), shows the groundwork of a chemical enzymatic method for the delignification of non-wood plants. The main aim of this project is to develop sustainable and environmentally friendly lignin degradation. The enzymatic method contains "laccase/mediator system" and the chemical method includes the H2O2 and NaOH. Model plants were the non-wood plants such as Spartina alterniflora (smooth mud grass) and Phragmites australis (reed). In total three enzymes were selected: the manganese peroxidase (MnP), the lignin peroxidase (LiP) and the laccase (Lacc). Each of the corresponding genes could be cloned and expressed in the yeast expression vector pPIC9K in P. pastoris. But only the laccase was synthesized in a sufficient quantity by P. pastoris, therefore only laccase in combination with mediator HBT and H2O2 were used for the delignification of plants.By photometric measurements of the absorbance and the determination of integral values of spectral ranges, of the samples with laccase, HBT and H2O2, have been achieved the reduction of lignin content in the plant material by 25 %.

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