Aufklärung von Pathomechanismen Desmoglein 2 Mutation verursachter Kardiomyopathie

Kant, Sebastian; Leube, Rudolf E.; Bohrmann, Johannes

doi:HT018996046

Aufklärung von Pathomechanismen Desmoglein 2 Mutation verursachter Kardiomyopathie = Identification of pathomechanisms in desmoglein 2 related cardiomyopathy

Kant, Sebastian

2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Diplom-Biologe Sebastian Kant

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online-Ressource (V, 156, VI-XII Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Leube, Rudolf E. (Thesis advisor) ; Bohrmann, Johannes (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-04-12

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-042382
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/658457/files/658457.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/658457/files/658457.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
desmosomes (frei) ; ARVC (frei) ; intercalated disc (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Desmosomen sind Zell-Zell-Kontakte, die in allen Epithelien und der Herzmuskulatur ausgebildet werden. Sie verbinden die Intermediärfilamentnetzwerke benachbarter Zellen und Mutationen in Genen, die für desmosomale Proteine kodieren, lösen Haut- und Herzkrankheiten aus. In dieser Arbeit wurde die Pathogenese der arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathie (ARVC) analysiert. Ziel war, die sequenziellen ARVC Pathogenesestadien zu charakterisieren und spezifischen morphologischen und molekularen Veränderungen zuzuordnen. Hierzu wurden Mauslinien mit Mutationen im desmosomalen Adhäsionsprotein Desmoglein 2 (Dsg2) hergestellt und charakterisiert. Es wurde sowohl eine knock-in Mauslinie (DSG2MT/MT) untersucht, die eine Dsg2-Mutante mit partieller Deletion der extrazellulären Domäne exprimiert, als auch eine konditionale Kardiomyozyten-spezifische knock-out Mauslinie (DSG2 cKO/cKO) etabliert und analysiert. Ein Teil der DSG2 MT/MT Mäuse stirbt bereits während der Embryonalentwicklung, die anderen Tiere werden mit morphologisch unauffälligen Herzen geboren. Sie entwickeln im Alter von 2-4 Wochen umfangreiche verkalkende Läsionen auf Grund nekrotisierender Kardiomyozyten. Immunzellen infiltrieren diese Bereiche und es werden kollagene Fasern eingelagert. Bis zu einem Alter von 12 Wochen flaut die Immunreaktion ab und es entstehen reife Narben. Die folgende chronische Phase ist durch interstitielle Fibrose gekennzeichnet. DSG2 cKO/cKO Tiere wiesen einen nahezu identischen Krankheitsverlauf auf. Die Ähnlichkeit der beiden Tierstämme zeigt, dass der primäre Adhäsionsverlust im Vordergrund der Pathogenese steht und nicht Dsg 2-abhängige Signalwege.Eine Vielzahl von Publikationen weisen dem junktionalen Plaqueprotein Plakoglobin eine zentrale Rolle bei der ARVC Pathogenese zu, da es nicht nur der Aktin- und Intermediärfilamentverankerung dient, sondern auch im Zellkern Einfluss auf den wnt-Signalweg nimmt. Dies basiert vor allem auf einer angeblichen Reduktion von Plakoglobin in den Glanzstreifen. In quantitativen Immunfluoreszenzanalysen wurde daher die Menge an Plakoglobin im Verhältnis zu anderen Glanzstreifenproteinen in unseren Mausmodellen bestimmt. Bis auf eine Abnahme des mutierten Dsg2 in den DSG2 MT/MT-Tieren und der Abwesenheit von Dsg2 in den DSG2 cKO/cKO-Tieren konnten keine Veränderungen nachgewiesen werden. Im Fall von Plakoglobin zeigten zwei verschiedene carboxyterminale Antikörper keine Veränderung, ein aminoterminaler Antikörper jedoch eine signifikante Reduktion. Diese Beobachtung konnte in menschlichen ARVC-Gewebeproben bestätigt werden. Unsere Erklärung ist, dass das aminoterminale Epitop von Plakoglobin in den pathologisch veränderten Glanzstreifen verschwindet. Ein Einfluss auf den wnt-Signalweg lässt sich daraus aber nicht ableiten.Eine präläsional erhöhte mRNA Expression des Skelettmuskelaktin (ACTA1) war eine der ersten identifizierbaren molekularen Veränderungen, die im Krankheitsverlauf weiter zunimmt. Die mRNA-Erhöhung war in Nachbarschaft der entstehenden, TGFβ-produzierenden Läsionen besonders ausgeprägt. In diesen Arealen konnte zudem eine Akkumulation von Aktin im Bereich der Glanzstreifen nachgewiesen werden. Als Ursache der präläsional erhöhten ACTA1 Expression konnte die Aktivierung des SRF Signalwegs durch Mrtf-a identifiziert werden. Diese Signalkaskade wurde zudem in Zellkulturexperimenten als Kardiomyozyten-spezifisch charakterisiert. Das Fehlen von typischen Desmosomen in den beiden mutanten Tierstämmen weist auf einen primären Adhäsionsdefekt durch das mutierte bzw. abwesende Dsg2, der vermutlich den Mrtf-a/SRF-Weg induziert. Die Narben-bedingten veränderten biomechanischen Eigenschaften und die erhöhten TGFβ-Spiegel führen zu einem zusätzlichen Verstärkereffekt.Zusammengefasst unterstützen meine Beobachtungen die Annahme, dass Veränderungen der kardialen Biomechanik kausal an der ARVC-Pathogenese beteiligt sind und einer Plakoglobin-Umverteilung keine grundlegende Bedeutung zukommt. Initiale Kompensationsmechanismen sind während der Adoleszenz und bei extremer körperlicher Belastung insuffizient und führen zu akuten Veränderungen, die tödlich sein können. Die zugrunde liegenden Mechanismen verstärken sich in einem „Teufelskreis“, in dem sich strukturelle und funktionelle Veränderungen gegenseitig hochschaukeln. Wenn es gelingt, diese kritische Phase zu überstehen bzw. effizient zu behandeln, sichern komplexe Mechanismen einen stark verlangsamten chronischen Krankheitsverlauf.

Desmosomes are prominent cell-cell contacts of all epithelia and heart muscle. They connect intermediate filaments of neighboring cells. Mutations of genes coding for desmosomal proteins have been identified in hereditary skin and heart diseases. In this thesis the pathogenesis of arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVC) was examined with the goal to define sequential stages of ARVC and to assign them to characteristic morphological and molecular alterations.To this end transgenic mouse lines were established and analysed with targeted mutations of the desmosomal adhesion protein desmoglein 2 (Dsg2). The knock-in mouse strain DSG2 MT/MT encoding a Dsg2 mutant lacking part of its extracellular adhesive domain was analyzed. In addition, the cardiomyocyte-specific knock-out strain DSG2 cKO/cKO was generated and characterized. Some of the DSG2 MT/MT mice die already during embryogenesis while the survivors are born with morphologically inconspicuous hearts. These animals develop, however, extensive calcifying lesions on the basis of necrotic cardiomyocytes starting at 2-4 weeks. Immune cells infiltrate these areas and collagen fibres are deposited. The immune reaction subsides for the most part until the age of 12 weeks when mature scars are formed. The ensuing chronic phase is characterized by interstitial fibrosis. DSG2 cKO/cKO animals present with an almost identical course of disease. The similarity of the developing phenotype in both strains shows that the primary loss of adhesion is most important for disease initiation and not Dsg2-dependent signaling pathways.Many publications have implicated the junctional plaque protein plakoglobin in ARVC pathogenesis, since plakoglobin is not only responsible for anchorage of actin and intermediate filaments but also influences wnt-pathway in the nuclues. The proposed pathomechanism stringently relies on reduced plakoglobin in the intercalated disc (ICD). To test this quantitative immunofluorescence analyses were performed to determine the expression level of plakoglobin in the ICD in relation to other ICD proteins in our murine ARVC models. Except for a decrease of Dsg2 in the DSG2 MT/MT mice and a loss of Dsg2 in the DSG2 cKO/cKO mice we could not detect alterations. In the case of plakoglobin two carboxyterminal antibodies did not show any alteration but an aminoterminal antibody revealed significant reduction. This observation could be confirmed in human ARVC tissue samples. An explanation is that the aminoterminal epitope of plakoglobin is lost in the pathologically altered ICDs. An influence on the wnt-signaling pathway, however, can not be derived from this observation.An increased mRNA expression was noted for skeletal muscle actin (ACTA1) prior to lesion formation which increased further during disease progression. The mRNA expression was highest in the vicinity of newly-formed lesions that produced TGF-β. In addition, accumulation of actin at ICDs was noted in these areas. Activation of SRF signaling through Mrtf-a could be identified as a cause of the early increase in ACTA1. Furthermore, cell culture experiments suggest that this ACTA1 expression is due to Srf/Mrtf-a activation in a cardiomyocyte-specific manner. The lack of typical desmosomes in both mutant strains suggests a primary adhesive defect through the presence of either the adhesion-deficient Dsg2 or the absence of Dsg2 altogether which likely induces the Mrtf-a/SRF pathway. Scar-induced change of biomechanical properties and the increased perilesional TGF-β levels likely lead to an additional amplifying effect.Taken together, my observation support the hypothesis that alterations of cardiac biomechanics are crucial factors of ARVC pathogenesis whereas a redistribution of plakoglogin is not a major factor. Initial compensatory mechanisms become insufficient during adolescence and in situations of extreme physical activity thereby leading to acute alterations that may be lethal. The underlying pathomechanism amplify in a detrimental cycle whereby structural and functional alterations influence each other. If this critical phase is survived or is therapeutically mitigated, complex mechanisms are in place to support a rather slow further development of the disease.

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